DNA損傷修復研究進展及其對圍術期認知功能障礙的影響

戎玉蘭，史成梅，郭向陽

(北京大學第三醫院 麻醉科， 北京 100191)

DNA損傷在發育-衰老、神經退行性疾病以及腫瘤等病生理過程中發揮著重要的作用。近來很多研究發現，腦細胞DNA損傷和修復之間的失衡會造成神經元損傷，并影響多種神經退行性疾病的發生發展。多種內源和外源性因素會造成DNA損傷。不同刺激引起不同的DNA損傷類型，主要有堿基錯配、堿基缺失、DNA單/雙鏈斷裂、DNA交聯等，其中雙鏈斷裂(double-strand break,DSB)是最有害的一種損傷[1]。每個細胞每天大約會經歷10 000次單鏈斷裂損傷和10～50次DSB。如果DSB沒有被修復或錯誤修復的話，會直接導致細胞死亡。DSB可通過兩種途徑進行修復[2]：同源重組(homologous recombination,HR)和非同源末端連接(nonhomolog-ous ending joining,NHEJ)。增殖期細胞可以借助姐妹染色體通過HR進行精確修復DSB，而有絲分裂期后細胞中的DSB則主要通過NHEJ修復[3]。有效的修復對于維持神經元功能至關重要，并且編碼DNA修復蛋白的基因與神經退行性疾病存在千絲萬縷的聯系[4]。

圍術期認知功能障礙(perioperative cognitive dysfunction,POCD)是一種常見的手術麻醉并發癥，以記憶、注意力、語言理解和社交能力的損傷為特征，可導致患者生活質量下降，延長住院周期、增加病死率，在老年人中的發病率高達25%～40%[5]，發生機制包括神經炎性反應、病理蛋白沉積、突觸功能障礙、線粒體功能障礙、DNA損傷與修復失衡、持續的腦損傷等，其中，DNA損傷及修復失衡是極其重要的一種機制。本文將以DNA損傷修復過程中主要參與蛋白質的功能為重點闡明NHEJ修復機制，并簡介其在POCD中的意義。

1 NHEJ的基本過程

NHEJ修復DSB的過程包括識別、聯會、末端加工和連接。DSB發生后，Ku異源二聚體(Ku70/Ku80)最先反應，它快速識別斷端并通過環狀結構與斷端結合，直接或間接招募NHEJ所需下游蛋白。同時Ku70/Ku80會迅速招募下游DNA蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase catalytic submits,DNA-PKcs)至斷端，形成DNA-Ku-PKcs三元復合物，穩定斷端，并進行聯會。接著核酸酶Artemis被DNA-PKcs募集到DSB位點，剪切斷端形成適合連接的結構。最后需要Ligase Ⅳ-XRCC4復合體、XLF和PAXX執行連接功能。

2 NHEJ的主要參與蛋白

2.1 Ku：快速識別蛋白

Ku二聚體由Ku70和Ku80組成，由基因XRCC6和XRCC5編碼，根據來源患者的姓名首字母和蛋白質的大小(70 ku和83 ku)命名。首次發現是一種自身免疫抗原，其與DSB斷端有高度親和性[6]。兩個蛋白含有相同的核心結構和N末端，只有C末端結構不同。它們可以組成穩定的環狀結構套在DSB末端并向內滑動，通過Ku80 C末端與DNA-PKcs相結合[7]。Ku70/Ku80在DSB末端的加載是整個NHEJ修復過程中至關重要的一步。它不僅可以像樞紐一樣與下游的修復蛋白合作，還可以與53BP1共同作用保護DSB末端免受核酸外切酶的加工[8]，并阻止其他修復方式的啟動，比如HR等，從而起到選擇修復通路的作用。NHEJ修復通路的大部分核心蛋白都與Ku產生相互作用[9]。

2.2 DNA-PKcs：穩定斷端蛋白

DNA-PKcs分子質量高達469 ku，具有激酶活性。DNA-PKcs的N末端可以形成一個鉗子樣結構，為DNA提供結合通道。它與斷端結合可發生自磷酸化，或被共濟失調-毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM基因)編碼的ATM蛋白激酶或Rad-3相關蛋白(ATM and Rad-3 related,ATR)磷酸化，也可以磷酸化Artemis并與之結合，起到促進核酸酶活性的作用，其主要作用就是調節并加速NHEJ修復通路[10]。DNA-PKcs不僅在NHEJ修復通路中發揮著重要的作用，也參與調節DSB位點NHEJ和HR修復通路的選擇[11]。

2.3 Artemis：末端加工蛋白

被識別的DNA斷端經過加工，才能進行下一步的連接，通常參與的蛋白質具有多種功能。Artemis具有5′-3′核酸外切酶活性，在體內、體外可被ATM、ATR或PKcs等多種蛋白激活，并且在不同的損傷條件下，會發生不同的激活途徑。Artemis與PKcs結合后，PKcs自磷酸化后可激活Artemis內切酶活性，切割突出末端以及V(J)重組過程中形成的發夾結構[12]。Artemis不僅是NHEJ修復通路的重要核酸酶，它同時也在調節細胞周期以及DNA損傷反應中發揮重要的作用[13]。

2.4 Ligase Ⅳ-XRCC4-XLF復合體：連接蛋白

Ligase Ⅳ只參與NHEJ修復通路，需要與XRCC4結合才能發揮作用。無論缺乏Ligase Ⅳ還是XRCC4都會出現對輻射敏感并且嚴重損害NHEJ修復通路[12]。XLF又稱為Cernunnos，雖然與XRCC同源序列有限，但因與XRCC4結構相似而得名，二者均以二聚體形式存在。在人類細胞中，只有XLF可與DNA-PKcs相互作用，并與DNA斷端結合形成核蛋白絲狀結構，起到支架作用，促進末端連接[14]。XLF不僅在NHEJ中起到重要作用，還可以穩定DNA的復制過程[15]。

3 NHEJ對POCD的作用

保持基因的穩定性是每一個細胞的重要功能，因此每個細胞都具有大量高效的修復蛋白來保證基因穩定。當DNA損傷不能被修復或發生錯誤修復時，就會導致進行性的或持續的神經損傷，從而影響認知或運動功能[16-17]。研究提示，如果腦中DNA 損傷和修復失衡，會造成神經元損傷，學習和記憶受損，并且被證實參與了很多神經退行性疾病的病理生理過程，比如阿爾茨海默病、帕金森病以及肌萎縮性側索硬化癥等。POCD是一種與年齡相關的神經退行性疾病。課題組研究顯示，圍術期因素可以通過氧化應激反應，誘導中樞前額葉區DSB發生，相關標志物蛋白γH2A.X的表達顯著增加，并在細胞核顯著聚集[18]。麻醉暴露還可以抑制中樞海馬區的P53水平，從而影響DSB程度，P53又可以影響NHEJ修復通路中的關鍵因子，從而調控NHEJ修復和細胞存活，另外NHEJ與P53之間也存在相互作用[19]?？梢妵g期因素可以影響DNA損傷和NHEJ修復之間的動態平衡，從而影響POCD的發生。

損傷和修復之間的失衡造成的DSB的積累是影響POCD的核心。減少DSB的發生，促進NHEJ，則成為干預、治療POCD的新靶點。已經發現通過補充葉酸或S-腺苷甲硫氨酸可以抑制DSB等DNA損傷的發生。因此，通過抑制氧化應激反應等途徑減少DSB的發生，可以降低POCD的發生率。對于脆弱腦細胞，NHEJ相關蛋白表達減少，從而造成DSB積累[20]，故如何促進NHEJ成為干預POCD的難點。

4 NHEJ近期研究進展

有關NHEJ的核心蛋白的研究已經很多，但是每個蛋白的具體工作機制還有很多需要探究，并且也有很多研究對NHEJ修復通路的經典過程提出了質疑和挑戰。新的研究提示XRCC-XLF是NHEJ修復通路的新核心蛋白，Ligase IV并不是NHEJ修復通路的必需蛋白質，XLF-XRCC復合體可以在DSB末端形成袖套結構，并在DNA鏈上滑動，成功高效的修復DSB，不依賴于Ligase IV的存在[21]。細胞試驗提示，與傳統的NHEJ序貫修復過程相反，在損傷初期，DSB位點就會形成一個超級NHEJ復合體，其中包括DNA-Ku-PKcs和連接蛋白，這些蛋白既可以獨立發揮作用，也可以相互促進，共同完成修復[22]。新的NHEJ調節復合物Shieldin(REV7、RINN1、RINN2、RINN3新型復合體)在2018年由多個課題組鑒定發現，它與CTC1-STN1-TEN1(CST)復合物相互作用，通過抑制DNA末端切除，促進NHEJ修復[23]。這些研究大大豐富了對NHEJ的認識。

5 問題與展望

雖然對于NHEJ修復通路的核心蛋白和機制已經研究的比較清楚，但其精確的作用方式及相互關系還存在很多空白：1)XRCC和XLF的C末端的結構還不是很清楚，在NHEJ中如何起到穩定作用？2)超級NHEJ復合體是否真的存在？3)POCD中，NHEJ修復通路是否受損？如何從修復角度進行干預，以影響POCD的發生和發展？

解決以上問題，需要結合蛋白組學、細胞生物學、有機化學等相關知識，深入研究NHEJ修復通路中的相關蛋白的空間結構，以及相互作用的順序與位點，探究NHEJ修復通路分子機制中的空白和疑惑。應用細胞、動物模型研究P53、γH2A.X等關鍵因子與NHEJ修復通路的相互作用，從而揭示DSB和NHEJ之間相互影響的分子機制。并開展相關臨床研究，探究脆弱腦功能患者的體液中，NHEJ修復通路相關蛋白的表達水平，以期能以NHEJ為核心，找到圍術期認知功能障礙的干預新靶點。