EBV miRNAs介導T細胞體內免疫的研究進展

林夢瑤，張 聲

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬于人類皰疹病毒4型，多數人易感并表現為無癥狀感染。1964年Epstein和Barr在培養的伯基特淋巴瘤細胞中發現EBV，可引起傳染性單核細胞增多癥、淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等疾病。EBV進入人體，最初感染口咽部上皮細胞，經病毒外膜糖蛋白gp350/220與B細胞表面CD21分子結合，隨后gp42/gH/gL/gB使病毒潛伏于B淋巴細胞中[1]。EBV通過病毒復制持續存在于感染個體中，并影響免疫應答過程，參與病毒感染的模式識別受體(pattern-recognition receptor, PRR)，調控固有免疫反應；在潛伏期和裂解期，抑制病毒蛋白的水平，從而降低免疫識別能力；利用非編碼RNA如EBER、miRNA等多個靶點逃避宿主免疫攻擊[2]。

在EBV基因組中，已鑒定出超過80個編碼蛋白的開放閱讀框(ORFs)以及大約30種不同的ncRNA，位于EBV BHRF1和BART區域的25個前體miRNAs編碼至少44種miRNA[3]。 miRNAs改變病毒和宿主基因的表達，調控機體的免疫能力，參與免疫逃逸、細胞增殖、凋亡和代謝等過程[4]。T細胞參與機體免疫自穩，識別抗原并維持記憶和自我耐受，在抗感染和抗腫瘤中起至關重要的作用[5]，但miRNAs如何影響T細胞免疫的機制尚不明確。本文對近年EBV miRNAs介導T細胞體內免疫的研究進展進行綜述，為進一步探討發病機制提供依據。

1 T細胞發育

T細胞起源于骨髓祖細胞的造血干細胞，在皮質-髓質交界處T細胞祖細胞進入胸腺，發育為早期T細胞祖細胞，隨后遷移至胸腺皮質，形成表達T細胞抗原受體(TCR)的CD4、CD8雙陽性胸腺細胞，經歷陽性與陰性選擇后成為成熟T細胞，隨血液輸送到外周系統[5]。

2 EBV miRNAs調控T細胞免疫應答

2.1 EBV miRNAs減弱T細胞特異性識別抗原的能力EBV進入人體后，B細胞和T細胞是主要的免疫細胞，其中抗原提呈細胞(APC)將病原體抗原遞呈給T細胞，T細胞通過免疫突觸及雙重識別辨認病原體抗原，CD4+T細胞和CD8+T細胞是參與適應性免疫應答的關鍵組分。CD4+T細胞介導溶酶體途徑(MHC Ⅱ類分子途徑，外源性抗原提呈)，APC攝取外源性抗原后，溶酶體降解抗原并與MHC Ⅱ類分子結合，供CD4+T細胞識別。CD8+T細胞介導胞質溶膠途徑(MHC I類分子途徑，內源性抗原提呈)，蛋白酶體降解內源性抗原，與MHC I類分子結合，供CD8+T細胞識別。

EBV miRNAs影響CD4+T細胞的抗原呈遞。miRNAs靶向CD4+T細胞應答中信號通路病毒產物的表達，關鍵調控物質為白介素-12亞基(IL-12B)和溶酶體蛋白酶，如豆類蛋白酶(LGMN：編碼天冬酰胺肽鏈內切酶AFP-豆莢蛋白)、組織蛋白酶B(CTSB)和干擾素γ誘導蛋白30(IFI30：編碼IFN調節的硫醇還原酶GILT)[6]，減少IL-12、HLA Ⅱ類分子以及溶酶體酶的分泌[7]。熒光素酶報告基因檢測發現miR-BART1、miR-BART2和miR-BHRF1-2通過3′UTRs調控IFI30、LGMN和CTSB的水平[8]。miRNAs影響CD8+T細胞識別抗原，通過降低細胞表面病毒抗原或腫瘤抗原遞呈的MHC I類分子，協助腫瘤細胞逃避細胞毒性T細胞的殺傷[8-9]。抗原加工相關轉運體(TAP)下調，抑制抗原肽與MHC分子結合形成pMHC，阻斷抗原肽向內質網運輸，減弱CD8+T細胞識別抗原及免疫應答的能力。

此外，EBV miRNAs能夠降低病毒抗原的表達，間接阻止T細胞特異性識別抗原。EBV有6個核抗原(EBNAs)和3個潛伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B)。如樹突狀細胞攜帶的LMP2A可以引起特異性免疫應答，以誘導CD8+T細胞依賴性免疫[10]，并影響MHC I類和MHC Ⅱ類分子途徑交叉提呈處理抗原[11]。miR-BHRF1-3靶向IFN介導的趨化因子CXCL-11/I-TAC的表達，減弱T細胞識別抗原的能力[12]。

2.2 EBV miRNAs降低T細胞活化、增殖與分化的水平T細胞經過活化、增殖和分化后參與機體免疫應答。根據表面標志物可以將T細胞分為γδT細胞和αβT細胞，αβT細胞由CD8+T細胞、CD4+T細胞和NKT細胞組成；CD4+T細胞繼續分化為Th1、Th2、Th9、Th17細胞等。

雙識別信號(抗原識別、共刺激)和細胞因子是T細胞活化的重要途徑，其中細胞因子是關鍵因素。如機體感染使樹突狀細胞分泌IFNγ和IL-12，促進T細胞增殖、分化為Th1細胞，該細胞表達轉錄因子T-bet，隨后產生IFN，促進Th1細胞的分化；IL-4激活STAT6信號，誘導T細胞形成Th2細胞，并拮抗Th1細胞分化；GATA-3是主要的調節轉錄因子；IL-17促使T細胞向Th17細胞分化，參與炎癥反應。

EBV miRNAs調節細胞因子影響T細胞活化、增殖與分化。研究表明，miRNAs參與多個免疫通路，下調與CD4+T細胞相互作用的關鍵分子。EBV+細胞高表達IL-12水平，支持免疫細胞信號的傳遞[13]。在體內IL-1β、IL-18和IL-12共同作用生成IFNγ，刺激T細胞向Th1和Th17分化和免疫應答，miR-BHRF1-2-5p阻止IL-1的信號通路，改變EBV相關性癌細胞中IL-1A和IL-1B的含量，間接干擾其他細胞因子的形成[14]。

2.3 EBV miRNAs阻止T細胞發揮效應初始T細胞遇到樹突狀細胞遞呈的抗原和共刺激配體，增殖分化為效應T細胞清除病原體。其中CD8+效應T細胞通過誘導細胞凋亡和分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，CD4+T細胞分化其他亞群進行免疫防御[15]，也能分泌細胞因子促進巨噬細胞的防御能力。清除病原體后，部分效應T細胞形成記憶T細胞。

CD8+T細胞經過次級淋巴器官循環，并通過TCR受體被樹突狀細胞激活，增殖分化的細胞毒性T細胞殺傷壞死和惡性細胞，防止機體感染和腫瘤形成[16]。研究發現，感染KSHV和EBV的B細胞可以將病毒編碼的miRNA轉移至T細胞，并抑制抗病毒反應[17]。記憶CD8+T細胞是抵抗病原體的主要成分，協同顆粒酶、穿孔素及細胞因子(如干擾素IFNγ、腫瘤壞死因子TNFα)介導殺傷效應[18]。

3 T細胞免疫與EBV相關性疾病的發生、發展

3.1 慢性活動性EBV感染其是由EBV引起的淋巴組織增殖性疾病，常見于東亞兒童和年輕人，臨床表現為發熱、肝脾和淋巴結腫大。實驗室檢查通常無特異性，外周血或受累器官中EBV-DNA水平升高是典型特征[19]。

目前，慢性活動性EBV感染發病機制尚不清楚，以往研究認為其與免疫系統異常和基因缺陷有關。Toyabe等[20]在慢性活動性EBV感染患者外周血中發現，抗原的免疫反應和EBV感染性T細胞的增殖是導致T細胞增高的原因。Fujiwara等[21]認為EBV感染的T/NK細胞中，常不表達特異性細胞毒性T淋巴細胞識別的免疫蛋白，如EBNA2和EBNA3s。相反，EBV永生化B細胞表達所有的潛伏蛋白。因此，EBV感染的T/NK細胞更易逃避免疫監視。此外，Onozawa等[22]研究發現慢性活動性EBV感染患者外周血單個核細胞中EBV感染的克隆增殖性T/NK細胞STAT3激活，并且JAK1和JAK2抑制劑魯索替尼(ruxolitinib)抑制STAT3的磷酸化及炎癥反應，同時降低EBV+T/NK細胞和外周血單個核細胞的活細胞數。Rodriguez等[23]發現慢性活動性EBV感染者出現PIK3CD和TNFRSF9純合子突變，維持EBV感染T細胞的積累，TNFRSF9基因突變導致CD137/4-1BB表達完全缺失，減弱T細胞表達的共刺激信號；編碼PI3K催化亞基p110δ的PIK3CD基因突變，降低激酶活性，減少T細胞的AKT信號。

有學者發現miRNA影響疾病發展。Kawano等[24]檢測19例慢性活動性EBV感染者、14例傳染性單核細胞增多癥和11例健康對照組的12個miRNA血漿表達水平，發現慢性活動性EBV感染者血漿中特異性EBV miRNAs水平不同程度升高。一些EBV miRNAs，特別是miR-BART2-5p、13和15，是疾病嚴重程度或預后的潛在生物學標志物。Zhang等[25]構建EBV編碼miRNAs的綜合表達譜，結果顯示慢性活動性EBV感染、EB病毒噬血相關綜合征和鼻咽癌患者中miR-BART19-3p表達上調，慢性活動性EBV感染樣本中APC mRNA表達與miR-BART19-3p呈負相關。

3.2 傳染性單核細胞增多癥其是由EBV感染的良性淋巴增生性疾病，常見于兒童和青少年，表現為咽喉疼痛、發熱、肝脾和淋巴結腫大。

Kaul等[26]對CD8+T細胞、NK細胞、單核細胞和B細胞的基因表達譜分析發現，在急性感染期，CD8+T細胞和單核細胞的關鍵基因群(I型IRGs、Ⅱ型IRGs、細胞周期/代謝基因)表達上調。Barros等[27]發現在傳染性單核細胞增多癥中絕大多數的EBV+細胞是B細胞，CD8+T細胞多于CD4+T細胞，EBER+、PD-L1+細胞的數量與EBER+、CD3+和EBER+、CD8+T細胞的數量直接相關，提示PD-L1是T細胞感染EBV的機制。另外，EBV特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞反應主要針對溶解蛋白，這些蛋白在感染急性期大量表達。急性期之后，記憶CD27+T細胞仍然存在，而效應CD27-T細胞的比例下降，當EBV重新感染時，記憶CD8+T細胞發揮最重要的作用[28]。

miRNA是調控機體免疫的關鍵因素。Gao等[29]檢測15例傳染性單核細胞增多癥患兒的病毒和細胞miRNAs水平，發現早期傳染性單核細胞增多癥患者EBV-miR-BHRF1-1、1-2-3P,miR-BART13-1、19-3p、11-3P、12-1、16-1明顯高于健康兒童，CD8+T細胞中hsa-miR-223、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-181a、hsa-miR-200a-3p、miR-155-5p、miR-155-146a、miR-155-142-5p等大部分miRNAs表達下調；隨著疾病的進展，CD8+T細胞的大部分miRNAs，包括hsa-let-7a-5p、hsa-let-142-3p、hsa-let-142-5p和hsa-let-155-5p表達降低。Hu等[30]分析30例傳染性單核細胞增多癥患兒和10例健康兒童外周血淋巴細胞亞群miR-BART16及其靶蛋白的表達，發現傳染性單核細胞增多癥患兒血清中miR-BART16表達明顯高于健康患兒，且與EBV拷貝數呈正相關。

3.3 EBV相關性胃癌其約占胃癌總數的10%，與EBV非相關性胃癌相比，EBV相關性胃癌的患者發病年齡較低，早期癌癥發生率高，多見于男性，病變好發于胃上部或中部，主要累及黏膜下層，鏡下見間質有高度浸潤的淋巴細胞，預后較好[31]。

EBV相關性腫瘤中，MHC的下調或增加PD-L1和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)的表達能使T細胞的監視功能失活[32]。EBV相關性胃癌常表現為ARID1A突變(55%)、BCOR突變(23%)、PIK3CA突變(68%)、DNA高甲基化、JAK2、ERBB2、PD-L1以及PD-L2擴增和罕見的TP53突變[33]。Su等[34]通過CRISPR-Cas9技術形成PD-1缺陷的細胞毒性T細胞，該細胞可以增強對EBV-LMP2A抗原的免疫應答，并且加大對腫瘤細胞的殺傷效應，對EBV相關性胃癌小鼠放療后，PD-1缺陷型細胞毒性T細胞的抗腫瘤效應大幅增加，提示PD-1/PD-L1通路是T細胞殺傷病原體和腫瘤發展的重要途徑。Chan等[35]發現，miR-BART5-5p直接靶向PIAS3的3′UTR，下調PIAS3蛋白水平、激活STAT3、增強PD-L1的表達。Sasaki等[36]發現經過JAK2、PI3K和mTOR抑制劑處理EBV相關性胃癌細胞后，PD-L1的表達水平降低到與未受IFNγ刺激細胞相同的水平，EBV相關性胃癌細胞表達高水平的PD-L1抑制T細胞增殖，IFNγ信號通路參與PD-L1的表達。Song等[37]在胃癌組織和細胞系中，發現上調miR-BART11可導致叉頭盒蛋白P1(FOXP1)下調，可能觸發癌細胞分泌IL-1β、IL-6、1L-10，導致胃癌患者生存期降低。

3.4 EBV相關性鼻咽癌鼻咽癌是鼻咽部上皮的惡性腫瘤，EBV感染是其中的危險因素，表現為鼻塞、涕中帶血、復視、頭痛，放療效果較好。

MHC I類分子編碼產物可以識別和遞呈抗原給細胞毒性T細胞，MHC I類分子的突變和失活破壞抗原遞呈機制，使EBV相關性鼻咽癌細胞逃離宿主免疫監視。EBV核抗原-1(EBNA-1)是機體感染的免疫識別位點，Fogg等[38]通過多肽和細胞因子刺激外周血單個核細胞，激活EBNA-1特異性CD8+T細胞的應答，發現該T細胞的免疫功能存在缺陷，從而促進鼻咽癌的發生、發展。Ye等[39]在鼻咽癌中發現外泌體miR-24-3p通過抑制FGF11表達，調節ERK和STAT蛋白的磷酸化，從而抑制T細胞的增殖和分化，調控癌細胞的生長。

4 展望

EBV屬于DNA病毒，主要通過唾液傳播，多數人易感，可以引起多種疾病。miRNAs是長度為20～24個核苷酸的小RNA，參與轉錄后基因表達調控。EBV通過miRNA調控腫瘤的發生、發展，介導T細胞改變炎癥因子的水平，可能是相關性疾病治療的潛在靶點。