心肌細胞鈣穩態失調在心力衰竭中作用的研究進展

劉峰宇，韓 薇

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 心血管內科，黑龍江 哈爾濱 150000)

心力衰竭(heart failure)是各種心臟疾病的終末期階段，其病死率和再住院率居高不下。近年來心力衰竭治療藥物和設備不斷取得進展，但中國心力衰竭患病率依然呈持續升高趨勢[1]。心力衰竭的機制復雜多樣，至今尚未完全闡明，因此，迫切需要進一步的認知及新的治療方案。本綜述從分子水平上闡述心肌細胞鈣穩態機制及其與心力衰竭的關系，識別在發病過程中影響鈣穩態的關鍵蛋白，為心力衰竭的診療提供潛在靶點和新的策略。

1 心肌細胞鈣穩態的生理特性

鈣作為第二信使，具有多種信號傳導作用，參與從肌肉收縮到細胞死亡的各種過程。這些過程的發生，依賴于通過鈣通道、ATP酶泵、離子轉運體和交換器與鈣結合蛋白等協同工作。心肌細胞的收縮功能受興奮-收縮耦聯(excitation-contraction coupling,ECC)的調控。收縮過程中，動作電位引起細胞膜去極化，使少量的細胞外鈣通過電壓門控的L型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC)進入胞質。這種鈣與2型蘭尼堿受體(ryanodine receptor 2,RyR2)結合，形成鈣火花，引發肌質網(sarcoplasmic reticulum，SR)內鈣通過RyR2短時間大量外流入胞質，產生鈣瞬變，這個過程被稱為鈣誘導鈣釋放(calcium induced calcium release,CICR)。細胞內鈣濃度增加約10倍，激活鈣敏感的收縮蛋白(肌鈣蛋白C，troponin C,Tn-C)，Tn-C利用線粒體所產生的ATP產生肌肉收縮。舒張期鈣主要通過鈉鈣交換器(sodium-calcium exchanger，NCX)和質膜鈣ATP酶(plasma membrane calcium ATPase,PMCA)從胞質中排出，約30%被轉運出細胞，70%通過心臟肌/內質網鈣ATP酶2a(sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a,SERCA2a)泵回SR。

心肌細胞線粒體供能對維持鈣穩態，以保障正常的收縮功能至關重要。此外，線粒體在介導細胞信號和細胞死亡途徑方面也發揮重要作用。線粒體的功能需要線粒體內鈣的參與[2]，線粒體鈣單轉運體(mitochondrial Ca2+uniporter，MCU)是線粒體鈣攝取的主要途徑，其活性依賴于細胞內鈣濃度；線粒體鈣從基質中排出是通過線粒體鈉鈣(Na+/Ca2+)交換器(MNCX)、MCU的反轉和/或線粒體內膜的通透性轉變來完成的。

2 心力衰竭時鈣穩態的病理性改變

鈣處理和轉運蛋白障礙導致細胞鈣瞬變振幅降低，持續時間延長，其結果是心肌收縮性降低，心輸出量減少。鈣處理蛋白的改變也會損害心臟傳導性，導致致命性心律失常[3]。下文從過量鈣進入胞質、肌質網膜鈣攝取降低、肌質網鈣含量減少以及鈣從肌質中滲漏等方面討論心肌細胞在心力衰竭過程中的鈣穩態失調。

2.1 細胞膜鈣轉運障礙

2.1.1 L型鈣通道:在人類心肌細胞中，胞質鈣內流幾乎全部通過LTCC發生。在心力衰竭期間，LTCC的磷酸化增加，衰竭的心肌細胞中結構組織喪失導致功能性LTCC從T管重新分布到肌膜[4]。Junctophilin-2(JPH2)是心肌細胞膜橫向T管與RyR2間形成的膜耦聯復合物(JMCs)的主要結構蛋白之一，在JPH2連接區域中誘導突變的JPH2(mutPG1JPH2)引起T管重塑，表明LTCC和JPH2之間的相互作用對于T管穩定至關重要[5]。在心臟病動物模型中，使用鈣通道阻滯劑可防止或逆轉病理性心臟重構。然而，臨床實驗中，非二氫吡啶類鈣通道阻滯劑增加射血分數減低型心力衰竭患者病死率和遲發性心力衰竭的發生率，這與鈣通道阻滯劑的負性肌力作用及神經內分泌的激活相關。

2.1.2 鈉鈣交換器:NCX是一種膜轉運蛋白，是真核細胞內鈣穩態調節的主要分子之一。生理情況下以正向模式工作，3個Na+進入細胞，1個Ca2+排出細胞。在心力衰竭期間，心肌細胞內Na+濃度上升，使NCX反向工作，導致在舒張期細胞內鈣外流減少，同時減緩鈣瞬變衰減速率，繼而導致胞質鈣超載。NCX的體外過表達損害心肌細胞的收縮功能。在心力衰竭動物模型中，神經調節蛋白(neuroglin-1β)的應用抑制NCX1的增加[6]，NCX慢性抑制劑SEA0400及ORM-11035的應用可維持心肌細胞鈣穩態，改善離體及在體心臟的舒張功能，抑制心室重構的發生[7]。

2.1.3 鈣庫操作性鈣離子通道:鈣庫操作性鈣離子通道((store-operated calcium entry，SOCE)是介導胞外Ca2+進入細胞內的重要通道之一，其核心由定位于內質網上的基質相互作用分子(stromal interaction molecule，STIM)和定位于細胞膜上的Ca2+選擇性通道Orai蛋白構成[8]。SOCE可以感知細胞內鈣耗竭并開放通道允許細胞外鈣內流，這一過程在心力衰竭的病理重塑過程中被加強。在主動脈縮窄所致心力衰竭的小鼠模型中，Orai1表達增加并出現Orai1依賴性SOCE開放，Orai1抑制劑的應用對心力衰竭小鼠產生保護作用[9]。表明抑制SOCE過度開放是治療心臟收縮功能障礙的一種潛在的有效治療方法。

2.2 肌質網與鈣穩態

2.2.1 肌/內質網鈣ATP酶2a:SERCA2a是心肌細胞鈣循環過程的關鍵蛋白，在心力衰竭的動物模型和患者中，SERCA2a的表達和活性均降低。SERCA2a敲除大鼠表現出明顯收縮功能障礙。

SERCA2a的生理功能受到多種蛋白的調控。PLN對SERCA2a活性的調控至關重要，PLN是肌漿網中的一種小磷蛋白，在心肌細胞中可逆地抑制SERCA2a，從而減少鈣離子流入SR。PLN可被鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)或蛋白激酶B(Akt)磷酸化。當PLN一或兩個位點被磷酸化時，其對SERCA2a的抑制作用減輕。心力衰竭期間心臟PLN蛋白的表達沒有變化，由于SERCA2a表達減少致PLN/SERCA2a比值升高，導致PLN對SERCA2a抑制增強。SERCA2a的翻譯后修飾對其活性影響同樣重要，小的泛素樣修飾物1(SUMO1)過表達可增加SERCA2a的SUMO蛋白質修飾化，改善心力衰竭小鼠及豬的心臟功能[10]。

2.2.2 蘭尼堿受體(RyR2):RyR2介導的鈣從SR釋放到胞質是興奮收縮耦聯過程中的關鍵事件。在肌肉舒張過程中，RyR2通道必須保持緊密閉合，以便SR鈣庫得到補充。在心力衰竭期間，RyR簇被破壞，導致較慢的Ca2+釋放動力學和舒張期Ca2+泄漏[11]。增加的β-腎上腺素能信號導致cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)在Ser28088及Ser2030位點過度磷酸化RyR2，導致其與通道穩定蛋白FKBP12.6的結合受損，RyR2的開放概率增加并在舒張期從SR泄漏鈣。在消融PKA心臟中，RyR2在兩位點均不能被磷酸化[12]。依賴于CaMKII的RyR2磷酸化也是心力衰竭中鈣通道活性的重要調節器。心力衰竭患者CaMKII水平升高以及依賴CaMKII的RyR2磷酸化增加，可能是舒張期SR鈣釋放增加的另一種機制。

2.2.3 肌質網鈣緩沖蛋白:肌質網內的鈣緩沖蛋白在EC耦聯過程中起重要作用。心肌肌質網中主要的鈣緩沖蛋白是鈣固縮蛋白異構體2(calsequestrin 2，CASQ2)，其通過降低肌質網內游離鈣離子濃度來促進SERCA2a在舒張期攝取鈣離子，保證收縮期時肌質網內有足夠的鈣儲備。CASQ2在mRNA和蛋白水平在心力衰竭中沒有改變，但在CASQ2敲除小鼠中上調肌質網對鈣的攝取導致心肌肥厚、收縮功能障礙與早期死亡率增加。

另一種認為在鈣吸收和釋放中起作用的肌質網鈣結合蛋白，是組氨酸豐富鈣結合蛋白(histidine rich calcium binding protein,HRC)。在心臟肌質網的管腔中發現的HRC已經被證明通過連接素(一種輔助膜蛋白)與SERCA2a和RyR2相互作用，這表明它與鈣穩態的調節密切相關。在心力衰竭動物模型中，非典型激酶Fam20C可以介導HRC、CASQ2及STIM1磷酸化，在維持心肌細胞鈣穩態中起重要作用[13-14]。

2.2.4 線粒體與鈣穩態:線粒體是心肌收縮所需的ATP形式的主要能量來源，Ca2+對線粒體功能調控至關重要。線粒體鈣穩態失調會損害線粒體功能，從而加重心力衰竭。線粒體基質中的[Ca2+]受MCU嚴格調控[15]。在衰竭的人類心臟和心力衰竭動物模型中，MCU水平升高[16-17]。但心力衰竭中線粒體鈣如何變化尚有爭議。

一方面認為線粒體鈣在心力衰竭中減少，其觀點主要包括以下4方面：1)心力衰竭心肌細胞SR鈣釋放速率和幅度的降低，降低線粒體對鈣的攝取；2)心力衰竭時NCX反向工作，但NCX介導的Ca2+內流在觸發線粒體Ca2+攝取方面效率較低。3)MNCX活性的決定因素是跨線粒體膜的鈉濃度梯度，在衰竭的心肌細胞中，升高的[Na+]加速線粒體Ca2+排出。4)心力衰竭時SR-線粒體Ca2+微域本身的結構也受到干擾，包括T管重塑，線粒體的異常聚集和連接SR的無序結構。

另一方面認為心力衰竭時線粒體鈣超載，在心肌梗死心力衰竭小鼠模型中，線粒體Ca2+超載，通過抑制線粒體Ca2+外流加重心力衰竭，而過表達NCLX可改善心力衰竭。這種相悖的理論及實驗結果可能是因為不同動物種類離子通道生理特性的差異，或各類心力衰竭模型中線粒體鈣穩態失調與心力衰竭發生的先后順序的不同，其潛在機制有待進一步研究。

3 鈣穩態失調的治療

對正常和病理狀態心肌細胞鈣轉運和信號的理解使得針對鈣處理蛋白治療的發展成為可能。治療的方向主要集中在通過增加肌質網鈣攝取或防止肌質網鈣泄漏，以改善肌質網功能以維持鈣穩態。

3.1 增加肌質網鈣攝取

在心力衰竭期間，SERCA2a的表達和活性降低。在阿霉素誘導的大鼠心力衰竭模型中，應用比索洛爾可提高SERCA2a活性從而改善心功能[18]。將SERCA2a基因轉移到衰竭的人心肌細胞中可改善其收縮功能，在多種心力衰竭模型動物應用腺相關病毒(AAV)心臟特異性過表達SERCA2a治療取得療效并評估安全性后后，2008年進行了首項人轉基因治療心力衰竭臨床實驗。CUPID(calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease)是第一項應用AAV1過表達SERCA2a治療晚期心力衰竭患者的臨床實驗，SERCA2a過表達可改善患者心力衰竭癥狀和/或延緩心力衰竭的進展，且對心臟的保護作用與治療的劑量呈正相關。然而，在后來的CUPID2及AGENT-HF實驗結果顯示，AAV1/SERCA2a并沒有改善心力衰竭和射血分數降低的患者的臨床病程[19]。這一陰性結果可能是源于研究納入的患者心臟對載體的傳遞和攝取不足。后續SERCA-LVAD研究在應用左室輔助裝置患者心臟中應用AAV1過表達SERCA2a，在CUPID2報告中性結果后試驗終止，同樣取得陰性結果[20]。SERCA2a基因過表達治療心力衰竭領域，安全性已得到證實，其治療方案及后續效果有待進一步探索。

針對SERCA2a的翻譯后修飾，近年不斷取得進展。SUMO1和S100A1的基因轉移均能促進SERCA2的活性，改善心力衰竭嚙齒動物和豬的心臟功能。SIRT1(sirtuin-1，III類組蛋白去乙酰化酶1)與p300(一種組蛋白乙酰轉移酶)在賴氨酸493位點去乙酰化，可恢復SERCA2a活性[21]。硝基氧基(HNO)通過直接翻譯后修飾靶蛋白(尤其是心肌細胞中的SERCA2a，PLN)上的巰基殘基，提高心臟收縮能力[22]。BMS-986231是一種HNO供體，其臨床應用安全性及治療效果在StandUP-AHF，StandUP-Imaging和StandUP-Kidney等II期臨床實驗中初步驗證[23]。

3.2 防止肌質網鈣泄漏

過度磷酸化或不穩定的RyR2通道導致肌質網在舒張期鈣滲漏，導致SR鈣含量降低和收縮期鈣瞬變減少，進而導致收縮性降低和心輸出量減少。抑制PKA或CaMKII過度磷酸化RyR2的一種治療策略是過表達RyR2調節蛋白FKBP12.6。FKBP12.6在小鼠心臟特異性過表達，或腺病毒介導的離體兔心肌細胞導致RyR2穩定，增加肌質網鈣含量，并改善心肌細胞收縮性。

一些部分抑制RyR2活性的藥物(氟卡胺、卡維地洛)可以減少舒張期鈣滲漏。丹曲林作為一種惡性高熱急性期治療藥物，用于心力衰竭期間，可選擇性地減少舒張期Ca2+泄漏，且不會抑制收縮期間的Ca2+釋放，驗證其對慢性心力衰竭患者的安全性和有效性的臨床實驗“SHO-IN”(日本臨床試驗注冊證標識符61180059)正在進行[24]。與丹曲林同屬于海因衍生物的苯妥英鈉亦可有效抑制RyR2介導的Ca2+釋放，其抑制作用與丹曲林相當，且具有更好的安全性[25]，但其在心力衰竭以及心律失常患者中的應用仍需臨床研究進一步驗證。一種新型藥物Rycals，可通過變構機制阻止RyR2的解離以穩定RyR2通道，從而減少SR的Ca2+泄漏。Rycals治療RyR1相關性肌病的臨床試驗(clinicaltrials.gov標識符NCT04141670)正在進行中，鑒于其特殊的藥理作用，今后有望應用于心力衰竭治療領域。

4 問題與展望

鈣穩態的維持受復雜網絡調控，而鈣穩態受損是心力衰竭的一個關鍵特征，其導致心肌收縮功能障礙和心律失常的發生。心力衰竭時鈣穩態缺陷最常見的原因為鈣離子轉運蛋白、結構蛋白、離子通道以及酶的表達及功能改變，導致細胞質鈣超載，肌質網內鈣含量減少。許多實驗結果促進了對這些途徑的理解，針對改善鈣穩態缺陷的治療方法近年來不斷發展，目前在動物模型和臨床實驗中已取得成效，但由于藥物不良反應的影響，以及對鈣穩態機制認識不足，限制了部分實驗結果向臨床的進一步轉化。隨著對機制的認識深入以及治療方法的探索，維持心肌細胞鈣穩態在未來對心力衰竭的治療中將取得更大進展。