缺血性腦卒中：褪黑素保護作用的新進展

史 梅綜述， 谷有全審校

卒中是全世界人類死亡和長期殘疾的主要原因，其中缺血性腦卒中是由向腦組織提供氧氣和營養的血管狹窄或閉塞引起的。由于腦組織高速消耗能量，血液供應不足導致大腦穩態失調，從而導致氧化應激、興奮性毒性、炎癥、血液-腦脊液屏障的破壞以及外周免疫細胞向缺血中心區的滲透[1]。目前，重組人組織型纖溶酶原激活物(rt-PA)靜脈溶栓和血管內治療是其優選的治療方法。然而，因為這些治療具有時間窗的限制，并非所有患者都能從中受益。近年來，褪黑素在腦血管疾病領域有了許多突破性的研究，本文將圍繞褪黑素抑制自由基產生和減輕氧化應激、信號轉導通路、減輕腦水腫及聯合其他藥物治療腦缺血方面進行綜述。

1 褪黑素在腦缺血中的作用

褪黑素在松果體中合成，釋放到血液和腦脊液中以發揮調節作用、控制晝夜節律，參與多種生理過程，包括情緒行為、血壓調節、卵巢生理和成骨細胞分化[2]。大量研究表明褪黑素與多種神經系統疾病有關，包括卒中、創傷性腦損傷、阿爾茨海默病和帕金森氏病等，且人們發現，血清和腦脊液褪黑素水平與年齡呈負相關[3]。

2 褪黑素在腦缺血時抑制自由基產生和減輕氧化應激

成年人的大腦只占總體重的2%，但卻獲得了總心輸出量的15%，消耗了總攝氧量的20%。中樞神經系統具有相對較低的內源性抗氧化水平。氧化應激(Oxidative Stress，OS)是腦組織缺血導致早期損傷的重要組成部分，與在病理條件下由于自由基(Free Radicals，FR)的過度形成而產生的興奮性毒性一起產生氧化和亞硝化應激，進一步損傷腦組織，造成神經功能異常。褪黑素通過非受體介導或增加抗氧化酶的活性和表達對活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)、活性氮簇(Reactive Nitrogen Species，RNS，)起到強大的清除作用[4]。此外，羥自由基在腦缺血中加重神經毒性，引起DNA損傷、ATP耗竭，褪黑素可以減輕腦組織缺血再灌注后產生的羥自由基依賴性損傷。ROS的產生涉及許多生物過程，NADPH氧化酶(NADPH Oxidases，NOX)被證明是ROS產生的主要催化酶，NOX2和NOX4是缺血性卒中大鼠腦組織ROS產生的主要亞型，可以誘導腦缺血再灌注模型大鼠的神經元凋亡和腦損傷，而褪黑素可以降低NOX2、NOX4的表達，從而降低ROS水平[5]。再者，谷胱甘肽可提高胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性，降低丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量，增強機體清除自由基的能力，減少大鼠腦組織氧自由基的堆積，在腦缺血條件下，谷胱甘肽的水平降低，給予褪黑素后可以觀察到谷胱甘肽水平顯著恢復[6]。此外，褪黑素還可以減少引起脂質過氧化和DNA損傷的大腦應激標志物，如MDA以及其他硫代巴比妥酸反應物質(Thiobarbituric Acid Reactive Substances，TBARS)[7]。

3 參與褪黑素對腦缺血神經保護作用的信號轉導通路

腦缺血啟動了很多的病理級聯反應，其中的每一步都是通過多條途徑進行調節的。褪黑素可以通過調控不同信號通路來參與腦缺血的病理生理過程。

3.1 褪黑素受體及其激動劑 褪黑素受體廣泛分布于中樞神經系統和外周器官。褪黑素受體有2種亞型，分為 MT1 和 MT2 型，這兩種受體均屬于G蛋白耦聯受體，在中樞神經系統廣泛分布。褪黑素受體可以快速激活多種信號級聯，隨后觸發保護作用，減輕缺血誘導的炎癥、氧化應激和線粒體功能障礙。MT1的激活導致多種G蛋白的刺激，抑制環磷酸腺苷(cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)依賴的信號轉導，降低蛋白激酶A(PKA)活性。同時，褪黑素受體MT2與多種信號轉導通路偶聯，包括磷脂酰肌醇的產生、腺苷酸環化酶(Adenyl Cyclase，AC)的抑制和可溶性鳥苷酸環化酶(soluble Guanylyl Cyclase，sGC)途徑的抑制[8]。近年來，褪黑素受體激動劑引起了研究者們的興趣。阿戈美拉汀是褪黑素MT1/MT2受體的激動劑，它的抗氧化和抗炎作用類似于褪黑素。Wijitra等[9]首次發現阿戈美拉汀治療顯著減少了神經細胞的凋亡，降低了促凋亡蛋白Bax和caspase-3的水平，增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，同時減少了神經元細胞凋亡，并且發現阿戈美拉汀顯著增加血紅素加氧酶1(Heme Oygenase-1，HO-1)、抗氧化酶的表達和SOD的活性，通過激活抗凋亡及抗氧化途徑有效減輕腦缺血再灌注引起的神經元損傷。近期進一步發現阿戈美拉汀可以通過調節Nrf2/HO-1途徑減輕永久性腦缺血后的腦損傷[10]。

3.2 鈣離子水平及鈣離子蛋白的調節 鈣離子是細胞內最重要的第二信使之一，對細胞內穩態的維持至關重要。褪黑素除了能清除線粒體中的FR和減少FR的形成外，還能有效地防止Ca2+穩態失調。在缺血再灌注條件下細胞內Ca2+超載，Ca2+被重排到內質網和線粒體，過量的Ca2+聚集在線粒體基質中會擾亂生物能量學，刺激線粒體產生ROS，并導致線粒體膜通透性增加、功能受損和塌陷。過量的Ca2+也會激活多種鈣依賴性的酶促蛋白，促進細胞骨架降解和自由基生成，引起細胞死亡或凋亡[11]。此外，動脈粥樣硬化鈣化的原因包括基質代謝失調、礦物質沉積、炎癥、氧化應激和細胞凋亡，血管鈣化主要由血管平滑肌細胞介導，褪黑激素通過AMP激活AMPK/OPA1途徑促進線粒體融合或有絲分裂，或通過AMPK/mTOR/ULK1途徑激活自噬，從而保護血管平滑肌細胞免于鈣化[12，13]。Hussain等發現褪黑素可能通過降低小電導Ca2+激活的K+通道的表達來改善腦低灌注大鼠的記憶缺陷[14]。

3.3 抗細胞凋亡 細胞凋亡的誘導和調節是復雜的，這一過程涉及一系列凋亡相關因子和信號轉導途徑。揭示神經元凋亡的機制，減少腦缺血后神經元的凋亡是非常重要的。作為細胞的動力來源，線粒體在介導哺乳動物細胞的凋亡途徑中發揮重要作用，線粒體的膜通透性受促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族成員的調節。當腦缺血再灌注發生時，Bcl-2表達減少，促凋亡因子Bax表達增加，細胞色素c通過線粒體外膜釋放，參與形成凋亡小體，最終導致細胞凋亡[15]。褪黑素通過增強沉默信息調節因子-1(Sirtuin 1，SIRT1)的表達來誘導Bcl-2的上調和Bax的減少來保護神經形態和功能免受破壞，并起到腦保護作用[16]。褪黑素抑制線粒體通透性轉換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore，MPTP)的開放，減少細胞色素C、Caspase的表達，減少細胞凋亡[17]。近些年，有研究發現褪黑素可以抑制內質網應激引起的細胞凋亡[18]。這些發現證明了褪黑素通過與凋亡級聯相關的各種機制發揮強大的抗凋亡作用。

3.4 PI3K/Akt的調控 PI3K/Akt信號通路調控多種細胞過程，包括細胞增殖、分化、存活和凋亡。生存因子激活Akt，Akt通過磷酸化激活轉錄因子來促進細胞存活，抑制凋亡。腫瘤抑制轉錄因子p53可介導缺血性卒中后神經元損傷[19]，褪黑激素通過PI3K/Akt途徑抑制p53磷酸化，增加神經元存活。有研究發現褪黑素在激酶催化區域Thr308位點上能更大程度的激活PI3K/Akt信號通路[20]。此外，γ-烯醇化酶，也稱為神經元特異性烯醇化酶(Neuron-Specific Enolase，NSE)，是直接評估神經元損傷和修復程度的重要分子。NSE通過激活PI3K/Akt信號通路來控制神經元存活、分化和軸突再生，而褪黑素可以增強NSE的神經營養活性，使NSE通過激活下游靶點(PI3K/Akt)從而產生神經保護作用[21]。

3.5 基質金屬蛋白酶 基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMP)是細胞外基質重塑、組織形態發生和傷口愈合所必需的物質。然而，在再灌注期間，金屬蛋白酶水平的上調會導致血腦屏障的破壞和炎癥。腦周細胞是中樞神經系統MMP-9的主要來源。褪黑素通過內源性MMP抑制劑和纖溶酶原/纖溶酶系統的雙重調節，有效抑制缺血后MMP‐9的激活和表達。在大腦中動脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO)動物實驗模型中，較長給藥時間及較高劑量的褪黑素對MMP-9的活性和表達都有明顯的抑制作用[22]。此外，褪黑素增強血腦屏障的完整性，可能是通過減弱IL-1β調節周細胞NOTCH3/NF-κB信號通路實現的[23]。

3.6 SIRT1 Sirtuins是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinu-cleotide，NAD+)依賴性組蛋白和非組蛋白去乙?；?，由7個成員組成(SIRT1至SIRT7)。2014年，Carloni[24]首次證明，褪黑素在缺氧缺血后保留了神經細胞中SIRT1的表達。褪黑素誘導的sirt1激活通過改善p53和Nf-κb的乙?；?，并促進腦中的抗凋亡信號，從而起到腦保護作用。另外，小膠質細胞是缺氧損傷的早期反應者，能嚴重影響神經元的功能，在動物模型中，褪黑素可在缺氧條件下抑制小膠質細胞促炎極化，這種作用最近被證明依賴于SIRT1及其下游的AMPK途徑[25]。除了缺血性腦損傷，在蛛網膜下腔出血模型中，褪黑素通過受體依賴機制改善神經功能評分，減輕腦水腫和神經細胞凋亡，這一過程是通過SIRT1/NF-κB信號通路增加Bcl-2的表達，降低Bax的表達實現的[26]。

3.7 SIRT3 最近的研究數據表明，除SIRT1外，SIRT3也與缺血性卒中相關，當腦組織缺血缺氧發生時，腦中SIRT3表達下調[27]。國內一項研究發現，短暫大腦中動脈閉塞模型中，褪黑素可以通過激活SIRT3信號通路，促進SIRT3的表達，減輕腦缺血再灌注損傷[28]。另外，褪黑激素可能通過STAT3途徑調節小膠質細胞和巨噬細胞向抗炎方向趨化來預防缺血性卒中[29]。

4 褪黑素與腦水腫

腦水腫是腦梗死致死的重要原因之一。缺血性損傷后，由于細胞內積累的溶質如鈉、氯化物等引起的細胞腫脹，以及細胞外含水量的升高，導致顱內壓升高，從而導致腦血流量的減少，進一步增加了缺血、顱內內容物突出、腦結構損傷、神經損傷甚至死亡。褪黑素可以改變水腫相關分子的轉錄活性，對缺血缺氧后腦組織具有保護作用，而水腫相關蛋白如水通道蛋白(Aquaporin 4，AQP4)、閉鎖小帶蛋白1(Zonula Occludens 1，ZO-1)可能間接促成了褪黑激素的水腫保護機制[30]。

5 褪黑素聯合其他藥物或方法治療腦缺血

褪黑素在許多疾病中的治療價值是眾所周知的，褪黑激素與其他藥物結合，可能會得到1+1大于2的結果，給卒中治療提供新思路。

5.1 聯合地塞米松 褪黑素和地塞米松聯合治療在減輕腦水腫、避免星形膠質細胞浸潤、抑制凋亡和金屬蛋白酶以及減少誘導型一氧化氮合酶表達方面提供了比單一藥物更大的有益效果[31]。

5.2 聯合美金剛 非競爭性NMDA受體阻滯劑美金剛，一種已知的神經保護劑，褪黑素和美金剛單獨或聯合使用可明顯減輕缺血損傷。在應激激酶p21、p38/MAPK和SAPK/JNK1/2通路失活中表現出減輕腦組織損傷的協同作用，特別是減少腦細胞的凋亡[32]。

5.3 聯合硒 硒具有清除FR的能力，通過參與抗氧化防御和氧化還原平衡調節大腦功能，可通過激活抗氧化酶的活性，減輕脂質過氧化作用保護腦組織。Ahmad等[33]在短暫性局灶性腦缺血模型中同時給予亞硒酸鈉和褪黑素，通過抑制誘導型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)表達，抑制炎癥反應，抗細胞凋亡來改善神經功能。

5.4 聯合針刺 針刺具有抑制炎癥反應、減輕腦組織損傷和水腫、促進神經再生的作用，國內一項研究[34]證明了在大鼠短暫性局灶性腦缺血模型中，褪黑素結合電針(刺激強度0.5 mA，刺激頻率2 Hz)可以顯著改善神經功能，包括減少梗死體積、腦部炎癥和TUNEL陽性細胞。

5.5 聯合黃體酮 黃體酮參與卒中的病理生理過程，包括水腫形成、神經毒性、血腦屏障破壞、細胞凋亡、炎癥反應和線粒體功能。Hedayatpour等[35]發現在大鼠腦缺血再灌注模型中，聯合給予黃體酮和褪黑素可以增加錐體神經元的存活并減少海馬CA1區的抗精神病因子，從而減少神經元死亡來增強學習和記憶等執行功能。根據這一研究結果，黃體酮和褪黑素的聯合可能是治療短暫性全腦缺血的潛在靶點之一。

5.6 聯合氧療 常壓氧具有神經保護作用，可增加腦組織中的氧分壓，改善有氧代謝，減少對血腦屏障(Blood-Brain Barrier，BBB) 的損傷，并減少急性缺血性卒中動物模型的缺血性腦損傷和梗死體積。常壓氧和褪黑素聯合治療可以通過減少梗死體積、減輕腦組織腫脹、減少細胞凋亡顯著改善缺血核心和半暗帶的腦血流量，從而降低腦缺血的神經缺損功能評分[36]。

高壓氧治療改善缺血相關器官功能障礙的機制可能主要是通過使缺血區氧壓升高(即短暫的高氧)、增加血管壁通透性和增加缺氧誘導因子-1α(Hypoxic Inducible Factor，HIF-1α)和基質細胞衍生因子-1α(Sromal-cell Derived Factor，SDF-1α)的生成，從而促進了缺血區的血管生成和增加循環血量[37]。最近國內一項研究發現，褪黑素或高壓氧單獨治療均可以改善急性缺血性腦卒中模型大鼠的預后并縮小了梗死面積，并且進一步證實褪黑素和高壓氧聯合治療在改善預后方面優于任何一種治療方式單獨治療[38]。

5.7 聯合抗癲癇藥物 托吡酯是一種耐受性良好的抗癲癇藥物，它通過阻斷AMPA/KA受體和發育過程中使用依賴的鈉離子通道而起到神經保護作用，已發現在新生兒缺氧缺血性腦損傷中起神經保護作用。褪黑素和托吡酯是兩種作用于不同缺氧缺血階段的藥物，無論單獨或聯合使用，都能顯著降低新生兒缺氧缺血模型的梗死面積百分比和凋亡細胞數[39]。

6 總結及前景

綜上所述，褪黑素作為一種有效的神經保護劑，在腦缺血性損傷的中起到神經保護作用，通過各種信號轉導途徑抗氧化應激、減少氧自由基、減少細胞凋亡。它也是參與神經元組織損傷的多個信號通路的多功能調節劑，可促進細胞增殖和神經再生，減輕腦水腫，單獨或與其他神經保護藥物聯合治療促進腦缺血后神經功能的恢復。目前還沒有研究表明褪黑激素具有嚴重的毒性。以上特點使褪黑素成為一種潛在的治療腦缺血性損傷的藥物。不足之處在于褪黑素對缺血性腦損傷的作用在動物模型上的被證實，但仍缺乏相關的臨床研究。希望隨著科技和醫療的發展，褪黑素可以逐漸在臨床應用上取得肯定的研究，在未來腦血管疾病，尤其在缺血性腦卒中中提供新的治療靶點，實現其實用價值。此外，褪黑素在缺血性腦卒中中的應用時機及劑量也需要進一步研究。