多組學技術在單基因遺傳病臨床診斷中的應用展望

宋正陽 蔣春明

遺傳病是指遺傳物質改變所致基因功能異常而導致的一類疾病，按遺傳方式可分為單基因遺傳病、多基因遺傳病、線粒體遺傳病和染色體病。單基因遺傳病，即孟德爾遺傳病，是指由一對等位基因控制的疾病。遺傳學分子診斷是指應用分子遺傳學技術對染色體、基因組、DNA序列等進行檢測，判斷患者是否存在遺傳物質突變。其中，DNA測序技術是最重要的分子診斷手段之一。迄今為止，仍有很大一部分遺傳病仍不能被明確遺傳病因，因此，越來越多的新技術被應用于遺傳病診斷領域。

組學是指對生物系統中的基因、蛋白質或代謝物進行高通量整體分析的技術，其中基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等已在臨床和基礎領域發揮了重要的作用，并被逐漸引入遺傳病領域，多組學技術也日漸被重視。本文就多組學技術在單基因遺傳病領域的應用現狀和進展作一綜述。

1 多組學技術在單基因遺傳疾病中的應用進展

隨著現代醫學不斷發展、組學技術不斷進步，如何突破單一組學研究的局限性成為了目前的研究熱點。將不同組學聯合應用于遺傳病的診斷，即將基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等多種組學數據相結合的多組學綜合分析方法，在理解復雜疾病的病理生理方面引起了人們的重視。

1.1 基因組學

1.1.1 靶向捕獲基因測序 靶向捕獲基因測序也稱基因panel，臨床上將多個基因或多個位點按照一定標準進行選擇和組合，從而檢測出對遺傳病有診治意義的基因。其原理是將若干靶基因對應的探針設計到同一張芯片上以捕獲目標DNA并用于后續檢測。對于遺傳特征明確的可疑疾病，基因panel檢測通常比全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）、全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）有更高的診斷率，因為其測序深度更高，靈敏度和特異度更好[1]。不同基因panel的診斷率各不相同，容易受到panel設計方案和遺傳表型及遺傳特征識別的影響。因此，在診斷不確定的情況下，選擇其他測序方法可能更合適。

基因panel是目前臨床上診斷各種明確表型或疾病的常規選擇，廣泛應用于先天性肌無力綜合征等神經肌肉疾病，遺傳性眼病、遺傳性運動障礙等遺傳性疾病的病因診斷。

1.1.2 WES 目前認為，僅占人類全基因組1%左右的外顯子區域，包含了85%的致病性變異，可以通過外顯子組測序直接識別孟德爾遺傳病的致病基因，其中WES對遺傳病診斷和新致病基因的發現具有重要價值。WES是一種靶向候選基因外顯子區域序列的測序方法，需要通過分子雜交和PCR擴增技術來富集目標序列。WES主要靶向蛋白質編碼區序列，也可能包含一些重要的基因調控區，如啟動子、5'-UTR等側翼區域，使得遺傳信息更全面，從而更有效地鑒定致病性變異。Platt等[2]在原發性免疫缺陷疾病的臨床診治中發現，與基因panel相比，WES可簡化工作流程，降低成本，并提高發現新的遺傳性疾病的能力。

Salfati等[3]研究報道，在12個月后對未確診的患者進行重分析可使診斷率提高11%，這使得WES與傳統基因panel相比性價比更高。隨著變異分類工具改進、基因數據庫和臨床表型識別的完善，WES數據重分析可能是提高孟德爾遺傳病的診斷效能的重要手段。

盡管WES對孟德爾遺傳病的分子遺傳學診斷具有劃時代意義，但是臨床上仍有50%～75%的孟德爾遺傳病無法通過WES得到基因診斷[4]。推測可能是因為WES僅覆蓋了基因組約2%的區域，無法檢測非編碼區所含有的對細胞發育和生物學至關重要的調控區域。非編碼區中存在影響RNA轉錄豐度的序列，其調控蛋白質表達在很多復雜的性狀和疾病中發揮了關鍵性作用。

當前，WES已是孟德爾遺傳病診斷中最常用的二代測序技術，診斷率可達到25%～52%，采用家系檢測可再提高16%的診斷率[5]。WES在神經系統疾病的診斷陽性率可高達30.6%，遠高于非神經系統遺傳病的陽性率（如皮膚系統17.2%、血液系統疾病17.1%）；對于癲癇或共濟失調的表型，WES檢測的總體診斷率達36.1%[6]。在明確家系遺傳傾向的情況下，WES的診斷率明顯超過了其他遺傳診斷方法，如染色體微陣列分析或基因panel檢測。隨著技術的成熟，WES已廣泛應用于癲癇、阿爾茨海默病、腦性癱瘓等神經系統疾病的臨床診斷。

1.1.3 WGS WGS是一種不受捕獲步驟和擴增反應限制的技術，對包括非編碼區在內的整個基因組進行測序和數據分析，能夠更好地覆蓋單核苷酸變異、插入和缺失和結構變異（structure variantions，SVs），包括較短和較大的拷貝數變異[7]。雖然目前提供的覆蓋深度低于WES，但WGS不需要外顯子捕獲或其他富集策略，在檢測內含子區域的致病變異方面有較高的效能。但當前對全基因組尤其是非編碼序列的致病性認識尚不充分，缺乏足夠的分析數據庫，且WGS對海量測序數據的處理（包括生物信息過濾、數據存儲、數據分析和解釋）需要耗費生信學家、遺傳學家和臨床醫生大量的時間，WGS測序成本也較WES高，使得WGS的臨床應用受到顯著限制[8]。

目前研究認為WGS具有廣泛的適用性，可顯著提高臨床診斷率。大量薈萃分析發現WGS診斷率幾乎是WES的兩倍，早期找到病因可有效改善患者的診治和預后，降低家庭復發風險，因此認為WGS比WES具有更高的性價比[7]。有研究發現WGS可用于識別阿爾茨海默病相關的罕見基因變異，特別是外顯子組之外的變異[9]，在脊髓小腦共濟失調等神經系統疾病中應用WGS的可行性和效能也得到了肯定[10]。盡管現在WGS尚未在遺傳性疾病的臨床診治上得到廣泛應用，但這該方法為更全面揭示遺傳性疾病的病因和發病機制提供了技術保障。

1.1.4 第三代測序技術（third-generation sequencing，TGS） TGS即長讀長測序/單分子測序技術，其特點是實時單分子測序，包括單分子實時測序和納米孔測序兩類技術。TGS是遺傳學領域的里程碑式的技術革新，實現了對每一條DNA分子單獨測序，測序過程無需進行PCR擴增，保留了二代測序的速度和通量優勢，且彌補了二代測序讀數相對較短、難以檢測到較大的SVS等不足。相比于第二代測序（next-generation sequencing，NGS），長讀長是 TGS的關鍵優勢，而通量低、錯誤率高和成本高是TGS的顯著缺陷[11]。臨床上，可以通過短讀長的NGS來修正TGS的長讀長片段測序的局限性[12]。目前TGS主要用于全基因組denovo測序、甲基化研究、點突變檢測、特殊基因區域等檢測[13]，例如癲癇、X連鎖性肌張力障礙-帕金森病等神經系統遺傳疾病。

TGS可能在不久的將來成為一種標準的罕見病診斷工具。最近研究顯示，TGS有助于明確其他基因檢測方法均無法檢測到的SVs，可協助驗證生殖細胞基因組的結構變異和分類，這對遺傳病篩查和干預具有重要意義[14]。

1.2 蛋白質組學 單基因遺傳疾病通常是由于特定基因中的位點變異所導致的蛋白質質量異常所致。蛋白質組學是鑒定和定量細胞、組織或有機體中全部蛋白質的一種技術，包括對蛋白質的結構和功能、表達和翻譯后修飾、蛋白質之間的相互作用等的研究[15]。蛋白質組學對疾病的早期診斷、動態監測和預后評估至關重要。隨著人類蛋白質組計劃的開展和臨床蛋白質組學技術的推進，當前只需要微量的體液（血漿或尿液等）或組織樣本就能夠可靠地檢測到＞90%的人類蛋白質，促進了臨床應用。然而，要提高蛋白質組學技術的可重復性和性能，還需要進一步的努力。多年來，蛋白質組學技術的應用一直面臨嚴峻挑戰和技術難題，結果受到蛋白質譜動態濃度范圍較大、剪接變體和翻譯后修飾等復雜因素的影響。近年來，蛋白質組學技術的靈敏度得到了極大的提高，也具有更大的覆蓋范圍。將蛋白質組學和遺傳學、細胞生物學方法相結合來研究疾病相關變異的細胞生物學功能，有助于識別與疾病相關的蛋白分子，并可為遺傳性疾病的發病機制研究、臨床診斷和治療提供新思路。在亨廷頓病[16]、遺傳性中性粒細胞減少癥[17]、線粒體疾病[18]等疾病領域的研究結果顯示，蛋白質組學在遺傳病診斷中具有較高的應用價值。

因此，不斷發展的蛋白質組學技術將加深人們對遺傳疾病的理解、診斷和管理，有利于對疾病診療實施精準的指導。

1.3 代謝組學 基因組學或蛋白質組學分析僅反映了部分生命活動，尚不足以解釋人類遺傳代謝性疾病的復雜性。代謝組學是20世紀90年代中期發展起來的一門新興學科，多用于研究相對分子質量1 000內的小分子代謝物，是遺傳代謝性疾病臨床診斷的重要依據。代謝組學分析能描述某種組織細胞的特定病理生理狀態，并對其進行定性和定量分析，其基本的研究方法分為靶向和非靶向兩種。這兩種方法可聯合用于對代謝產物的鑒定和定量，以及代謝相關分子標志物的分析研究。由于樣本收集和儲存的條件會影響代謝物的豐度[19]，因此，標本穩定性是代謝組學技術發展必須要克服的問題之一。

隨著WES的應用逐漸廣泛，發現了很多與臨床表型相關但致病性不確定的變異，結合代謝組學技術可為其得到更準確的基因診斷提供實驗室證據。臨床上，代謝組學技術多用于檢測和監測先天性代謝異常[20]，已有多個研究報道了代謝組學技術成功應用于先天性銅代謝障礙等疾病[21-22]，代謝組學技術是下一代遺傳代謝病的重要篩查技術。

1.4 轉錄組學 轉錄組是特定組織或細胞在某一發育階段或功能狀態下轉錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。由于受到當前測序技術和基因功能認識的限制，學者推測很多遺傳性疾病可能是由于轉錄水平發生各種異常而導致的，因此不可能僅依靠基因組測序來解決。轉錄組測序（RNA-sequence，RNA-Seq）是一種可以對特定時空狀態下的器官組織進行轉錄組分析的高通量測序技術，可以直接檢測RNA豐度和RNA序列的變異，彌補了DNA遺傳信息的局限性[4]，具有高精度、高靈敏度和高穩定性的特點，可提高遺傳性疾病的臨床診斷率[23]。這為RNASeq作為一種DNA測序的補充手段的臨床應用提供了重要依據。但由于轉錄組存在高度的時間、空間特異性，如何選擇最佳的組織進行檢測是臨床面臨的重要挑戰[24]。此外，RNA-Seq對數據存儲要求較高，其數據的生物信息學解讀難度大，都限制了臨床應用。雖然現已有表達變異分析技術等輔助工具來幫助分析轉錄組測序數據[25]，但臨床解讀仍是巨大挑戰。

近年來，已有較多研究將其成功應用于線粒體疾病和神經肌肉疾病等先天性代謝性疾病的臨床。研究證實，RNA-Seq有助于甲基丙二酸尿癥[26]、線狀體肌病[27]、罕見遺傳性皮膚病[28]等疾病的臨床診斷；尤其適用于WES陰性的累及皮膚肌肉相關遺傳性疾病的患者，因為肌肉、成纖維細胞等組織容易獲取且適于RNA-Seq 檢測[29]。

綜上所述，雖然目前RNA-Seq不是診斷孟德爾遺傳病的常規診斷技術，但確是提高罕見遺傳病分子診斷的重要補充診斷技術。

2 多組學聯合在遺傳性疾病中的應用進展

隨著現代醫學和組學技術的不斷進步，如何突破單一組學研究的局限性已成為當前該領域的研究熱點。將不同組學技術聯合應用于遺傳性疾病的診斷，即將基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等多種組學數據相結合的多組學綜合分析方法，在理解復雜疾病的病因機制方面日益受到人們的重視。

聯合應用NGS和代謝組學篩查可以發現新的致病基因和生物標志物[30]，可提高遺傳性代謝缺陷病的診斷效能，進一步提高診斷率和縮短診斷時間[31]。研究發現，基因組學與其他多組學數據的整合分析，可有效提高單基因遺傳病的診斷效能和明確潛在的治療靶點，從而實現早診早治和改善預后，例如將基因組和轉錄組聯合應用可提高阿爾茨海默病[32]、特異性皮炎[33]等疾病的精準診治。迄今為止，臨床上已經開發了大量針對單基因遺傳病診斷的多組學聯合檢測技術和多組學數據整合分析工具，來提高遺傳罕見病的分子診斷效能，但該領域仍進展緩慢。

3 展望

隨著多組學技術的突破，基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組等生命信息將對單基因遺傳病的診斷和治療發揮越來越重要的作用。今后的研究應該使用系統生物學方法整合多組學數據，并積極運用于遺傳性疾病的診斷和治療領域。在將多組學技術引入臨床實踐的過程中，存在一些問題尚待解決[34]。首先，要克服不同組學技術的臨床局限性，深入理解多組學數據的潛在生命疾病信息；其次，要開發多組學數據之間的整合分析技術和平臺，揭示數據的互補性和整體性，以推動高特異度和靈敏度的生物標志物的發現；再次，要解決由于樣本收集、處理、儲存和運輸等產生的影響，以及不同制造商生產的組學圖譜平臺的技術差異；最后，多組學數據安全和患者隱私等倫理問題尚待深入研究解決。此外，要建設規范的多組學醫學遺傳診斷模式，組建臨床醫生、實驗室專業人員、生物學家、甚至律師和倫理專家等多個領域專家的多學科遺傳病診斷團隊，以開啟基于多組學數據整體解讀的未來單基因遺傳病診斷時代。