兒童狼瘡性腎炎尿液生物標志物研究進展

王建敏 毛建華

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）是一種具有多種臨床癥狀的慢性自身免疫性疾病，涉及反復的慢性炎癥和急性加重。狼瘡性腎炎（lupus nephritis,LN）是SLE主要的也是最嚴重的臨床表現之一。20%左右的SLE在18歲之前確診，相較于成人SLE 40%～50%的LN發生率，兒童發生LN的概率高達80%，且常見于初次確診的早期[1]，同時腎衰竭和死亡的風險也高于成人。腎活檢的組織學證據不僅是診斷LN和確定腎小球、腎小管和間質病變程度的金標準，而且對治療方案有指導作用。但腎活檢是一項有創操作，有較大的并發癥風險，尤其在兒童中，因此不適合反復多次進行。因此，臨床上更加依賴侵入性較小的血液或尿液的相關指標來監測LN的活動情況及治療效果。目前用于監測和評估LN的常規實驗室指標，如24 h尿蛋白定量、尿蛋白/肌酐、ESR、肌酐清除率、抗雙鏈DNA抗體和補體水平，對早期發現腎損害的靈敏度和特異度均較低。而LN的致病過程可能在腎功能受損和實驗室指標檢測到之前就開始了。對于LN的管理，越來越傾向于采用非侵入性生物標志物來實現。近年來，有前景的LN尿液生物標志物已經發現，可有效反映LN的活動性、復發傾向及對治療的反應。

生物標志物是一種生物、生化或分子物質，可以通過實驗室技術定性和定量地檢測到，它與疾病的發病機制或在不同時間點的活動相關。因此，生物標志物可能具有診斷或監測價值，也可能預測患者對治療或病程的反應[2]。對于LN來說，理想的標志物應當具有以下特點：（1）對SLE患者的腎臟受累有高度特異度；（2）能夠建立與腎臟活動或損害的相關性；（3）可以縱向連續監測LN的疾病狀態；（4）比常規臨床或實驗室參數更早地預測腎損傷，以便及時給予干預措施；（5）能夠評估預后和治療反應，以便臨床醫生能夠識別哪些患者可能受益于更積極的治療；（6）對于組織學分類和腎活檢結果有提示意義[3-4]。在LN中，尿液越來越被認為是比血液更理想的發現生物標志物的媒介，因為尿液直接來源于腎臟組織，成分相對穩定。相比血液復雜的蛋白質數量及種類，尿液中僅含有2 000多種蛋白質，其中30%來自血液循環，70%來自泌尿系統本身。這些尿蛋白的改變反映了腎臟的生理和病理變化，所以更有可能產生LN腎臟特異性的生物標志物。LN的尿液生物標志物在兒童中若能提高早期診斷率、改善疾病監測和治療反應評估的方法，對于兒童LN的管理及避免難治性兒童LN重復腎活檢是非常有意義的。許多候選的尿液生物標志物，如趨化因子、細胞因子、生長因子和黏附分子等，已經被評估為LN潛在的生物標志物，在兒童中有所研究。本文就兒童LN尿液生物標志物的研究進展作一綜述。

1 尿趨化因子

1.1 單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1） MCP-1是最早被描述的趨化因子之一，也是目前研究最廣泛的尿液生物標志物之一，由腎臟中的系膜細胞、內皮細胞、腎小管上皮細胞和平滑肌細胞產生[5]，它主要通過與CC趨化因子受體2（CC chemokine receptors 2,CCR2）結合，在炎癥和組織損傷中調節炎癥細胞的運輸和集聚[6]。MCP-1在腎臟疾病動物模型和腎臟患者中的作用已被研究和分析，在LN中主要促使炎癥細胞浸潤腎臟，進而導致腎臟炎癥和組織損傷。大量兒童和成人的橫斷面及縱向研究表明，與對照組（非活躍LN和/或健康對照）相比，活躍LN患者的尿MCP-1水平升高。

在兒童LN的一項多中心縱向研究中，Watson等[7]檢查尿MCP-1在64例兒童LN患兒中的水平，發現MCP-1是活動性腎病的獨立預測因子，尿MCP-1水平是腎臟疾病隨時間改善極好的預測因子。在一項觀察性研究中發現尿MCP-1與蛋白尿呈正相關，與腎小球濾過呈負相關，不管疾病活動度和腎臟受累情況如何，SLE患者尿MCP-1水平都明顯高于健康對照組[8]。MCP-1甚至會在腎臟復發及活動前2～4個月時顯著升高。這對于早期確定兒童SLE的治療方案和采取進一步措施預防腎損害有重要意義。最近一些研究表明尿MCP-1聯合腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子（TWEAK）等與系統性紅斑狼瘡腎臟疾病活動指數（renal systemic lupus erythematosus disease activity index,rSLEDAI）及活檢活性指數（biopsy activity index,BAI）相關性更好，并建議用于監測疾病活動和治療反應[9-11]。所以建議在兒童LN中可常規檢測尿MCP-1，用于監測腎臟的疾病活動和治療反應，并且可以進一步研究基于抑制尿MCP-1表達的藥物，從而為兒童LN的治療開辟新的思路。

1.2 IFN-γ誘導蛋白 10（C-X-C motif chemokine 10,CXCL10） CXCL10是CXC趨化因子家族的一部分，該家族的趨化因子具有促炎特性，它是一個10 kDa的蛋白，被歸類為Th1趨化因子，在IFN的刺激下，由浸潤的單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞分泌，然后與受體CXCR3（主要在T淋巴細胞上表達）結合來調節免疫反應[12]。

研究發現，與非活動期SLE患者和健康對照組相比，活動期LN患者的尿液CXCL10顯著升高，并且與SLE疾病活動度指數（systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI）和臨床醫師對疾病活動度的整體評估有良好的相關性[13]。一項橫斷面研究顯示，尿CXCL10水平在LN患者中明顯高于無LN的SLE患者，使用LN（有或無）和CXCL10（陰性或陽性，最佳截斷值為0.93 pg/ml）作為二分類變量，CXCL10被發現是LN的高靈敏度（100%）和高特異度（98%）的有效預測因子，可以證實在LN患者中CXCL10與24 h尿蛋白、SLEDAI、腎活檢分級等呈正相關[14]。然而在一項在兒童患兒中的研究發現，尿CXCL10在活動性LN、非LN患兒和對照組之間沒有差異，這體現了成人LN和兒童LN的異質性[15]。

2 尿細胞因子

2.1 腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子（tumour necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）TWEAK是TNF超家族配體中的一員，是一種多功能細胞因子，可與其受體成纖維細胞生長因子誘導14蛋白（fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14）結合，介導多種生物活性，包括激活細胞生長、遷移或死亡，誘導血管炎和血管生成，以及促進成纖維反應。TWEAK在許多組織中普遍表達，在腎臟中，Fn14由腎固有細胞（包括足細胞、系膜細胞、腎小球內皮細胞和腎小管細胞）表達。正常情況下，Fn14在健康腎臟組織中普遍低表達或缺失，但在組織損傷、自身免疫及炎癥時被迅速誘導，不受調控而過度激活，同時TWEAK水平相應升高[16]。在這種情況下，就可能會導致腎臟的進行性損傷和惡化。

因此，該細胞因子的尿液測定作為LN的生物標志物是非常有意義的。研究顯示活動期LN患者的尿TWEAK水平明顯高于沒有或非活動期腎病和正常健康受試者[17]。當聯合尿MCP-1時，在評價預后不良的腎損害時比其他參數（a1-微球蛋白、β2-微球蛋白、肌酐等）具有更好的鑒別能力，因此很適合作為一種篩查工具。在沒有病理結果的情況下，以腎活檢為中心，聯合尿MCP-1和TWEAK，可快速鑒別嚴重LN患者，對腎損害進行更全面的評估[9]。鑒于TWEAK/Fn14的激活在LN發病機制中的重要作用，阻斷TWEAK/Fn14軸對于LN的預后或許有很大改善。研究指出，Fn14敲除的雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿水平顯著低于野生型雌性MRL/lpr小鼠，并且Fn14基因敲除小鼠的蛋白尿及腎組織病理學有顯著改善，且伴有腎小球和小管間質炎癥的減弱[18]。筆者認為隨著更多大樣本、多中心的研究深入，臨床對于TWEAK在LN的作用會越來越清晰，抑制TWEAK/Fn14途徑也會成為LN治療的一個有吸引力的靶點。

2.2 骨保護素（osteoprotegerin,OPG） OPG是一種來自TNF受體超家族的可溶性蛋白，因其最具特征的作用是通過減少破骨細胞的生成來調節骨吸收，故而得名。人OPG基因位于染色體8q上，由5個外顯子組成，已經發現OPG在腎臟中有表達，包括腎臟樣本、培養的腎小管細胞和尿外泌體樣囊泡[19]。

研究表明，尿OPG水平升高與rSLEDAI之間存在關聯，當OPG同時與TWEAK、MCP-1和IL-8評估LN活動時，有更合理的靈敏度、特異度和預測價值[20]。另外在縱向研究中還發現，盡管尿OPG和血OPG在治療隨訪中顯著下降，但血OPG的下降趨勢穩定性低于尿OPG，與抗雙鏈DNA抗體、補體3、補體4和血OPG相比，尿液OPG在區分活動性LN患者方面有表現更好的AUC[21]。綜上，尿OPG檢測可能對預測LN治療的不良反應和復發有價值，期待在兒童LN中有更多的研究，以進一步驗證其價值。

2.3 轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β） TGF-β是一種具有廣泛生理活性的二聚肽，在形態發生功能、免疫系統及組織重塑的調節和傷口的修復中發揮重要作用[22]。在炎癥發生時，TGF-β主要在腎小球和腎間質中表達，刺激常駐間質細胞和募集血管周細胞向肌成纖維細胞的轉變，以進一步刺激細胞外基質沉積，導致組織瘢痕化，最終導致慢性腎臟病（chronic kidney disease,CKD）[23]。

在兒童患兒中，已觀察到活動性LN患兒尿TGF-β水平顯著升高，并與抗雙鏈DNA滴度呈正相關。近期在一項對87例兒童和青壯年的LN患者（平均年齡15.6歲）連續研究中發現，對于治療有反應的LN患者尿TGF-β顯著低于無反應者[24]。另有研究發現無論是輕度LN還是嚴重LN，患者的尿TGF-β水平均高于正常對照組，提示尿TGF-β水平對LN有診斷意義，當聯合尿中性粒細胞明膠酶相關脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）則有更高的靈敏度和特異度[25]。最近一項研究使用一種新穎的、定量平面蛋白微陣列技術對SLE患者的尿液進行了1 000個蛋白質的檢測，發現尿TGF-β與疾病活動度高度相關，建議尿TGF-β可作為追蹤LN疾病活動的潛在生物標志物[26]。無論如何，尿TGF-β在診斷LN和監測LN活動上都體現了其價值，期待更多大型的獨立隊列研究來證實其在兒童LN中的價值。

3 NGAL

NGAL是一種25 kDa的分子，最早在中性粒細胞中發現，在腎臟中呈結構性低表達，在炎癥、缺血和感染等腎損傷時表達上調，NGAL已經在LN中被廣泛研究。在一個獨立的兒科隊列研究[27]中，納入了33例兒童SLE患兒（22例LN，11例非LN）與15例健康對照者，發現LN患兒尿NGAL水平高于非LN患兒及健康組，尿NGAL水平與rSLEDAI評分相關，并可預測Ⅲ型和Ⅳ型LN（靈敏度0.91，特異度0.70），提示尿NGAL是兒童增殖性（即Ⅲ型和Ⅳ型）LN的敏感標志物。當NGAL聯合尿TGF-β時，其LN的診斷有較高的靈敏度和特異度[25]。另外一項多中心研究顯示，尿NGAL在區分LN完全緩解、部分緩解和無緩解方面均優于血肌酐、尿蛋白、GFR等常規生物標志物[28]。更值得關注的是，研究顯示尿NGAL水平在腎臟活動早期（3～6個月）就開始升高，這大大增加了NGAL作為LN早期生物標志物的可能性[29]。

4 血管細胞黏附分子

4.1 血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1） VCAM-1是一種90 kDa的糖蛋白細胞黏附分子，有助于調節炎癥相關的血管黏附以及巨噬細胞、T細胞等白細胞的跨內皮轉移。VCAM-1在正常兒童的腎小管上皮和腎小球內皮細胞中表達較差，但在增生性LN存在時表達增加，與疾病活動相關[30]。一項納入了227例SLE患者的研究顯示，80例活動性LN患者尿VCAM-1顯著高于非LN患者和對照組，并且與SLEDAI評分、rSLEDAI評分以及尿蛋白/肌酐比值顯著相關[31]。另一項研究顯示尿VCAM-1/肌酐比值在活動性或低活動性LN患者中高于非活動性LN患者，當尿VCAM-1/肌酐比值基線為75百分位及以上的患者，在10年隨訪期間，腎小球濾過率惡化≥25%的風險增加了23倍，而包括抗雙鏈DNA抗體在內的傳統標志物無法預測這一結果[32]。因此，尿VCAM-1水平高可能表明患者長期腎功能喪失的風險增加。因此，該黏附分子的尿液測定對于LN的長期預后監測有很大意義。期待VCAM-1在兒童LN中有更深入的研究。

4.2 血管抑制素 血管抑制素為纖溶酶原N端片段，是一種抗腫瘤分子，通過減少內皮細胞增殖和中性粒細胞的激活和遷移，抑制炎癥和血管生成[31-33]。尿血管抑制素水平在活動期SLE患者中升高，已被用于確定疾病活動度的一個指標，另外，血管抑制素水平也有助于區分LN活動的SLE患者和非LN活動的SLE患者，與傳統的LN生物標志物相比，其有更高的特異度和靈敏度[31-33]。在一項研究中報道，高尿血管抑制素水平與SLEDAI、rSLEDAI和SLE國際合作臨床損傷指數腎臟活動評分呈正相關，其特異度、靈敏度顯著高于蛋白尿/肌酐比值[33]。在腎活檢時分析發現，血管抑制素在正常組織中無表達，在Ⅱ級LN患者中低表達，在IV級LN患者水平最高。另一個發現是血清血管抑制素與任何疾病評分或尿血管抑制素水平無關，表明該分子具有腎臟局部生成的特性。一項近期的研究評估了尿血管抑制素、VCAM-1和CXCL4在SLE患者中的水平，發現與血清抗雙鏈DNA及補體3相比，尿血管抑制素在鑒別活動性腎性SLE和活動性非腎性SLE時有更高的靈敏度、特異度[31]。綜上，血管抑制素有可能作為SLE腎損傷的特異性標志物，需要進一步在兒童LN中研究以確定其效用。

5 其他尿液生物標志物

目前，全世界范圍內都在積極尋找LN潛在的生物標志物[26,34-36]，如細胞因子IL-2、IL-23、IL-38[37]，蛋白質N-乙酰-b-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-b-D-glucosaminidase,NAG）、a1-抗胰凝乳蛋白酶[38]、腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）[29]、高遷移率族框1 蛋白（high-mobility group box 1 proteins,HMGB1）[39]、轉鐵蛋白及銅藍蛋白[40]、觸珠蛋白（haptoglobin,HAP）及α-1抗胰凝乳蛋白酶[41]、尿促血栓、抗血栓和纖溶分子[42]、尿mRNA[43]等均有研究。但是目前尚缺乏在大型隊列研究數據。

6 小結和展望

幾十年來，在LN中已經研究了大量的尿液生物標志物，并進行了大量的驗證，而且有新的生物標志物不斷被發現，但由于各項研究的異質性，包括評估方法、檢測方法、使用工具的差異等，目前仍然沒有一種生物標志物能很好地適應臨床的需要。越來越明顯的是，沒有哪一種單獨的生物標志物在評估LN的活動性及慢性程度或者預測LN的發生上能體現最佳的特異度和靈敏度，所以需要開發多種生物標志物來聯合監測LN患者。已有一些這方面的努力，如狼瘡腎臟活性指數（renal activity index for lupus,RAIL）項目[44]。目前的LN尿液生物標志物數據多是來自于成人隊列，由于兒童LN更差的預后，更高的CKD發生率，所以比成人更迫切需要合適的生物標志物應用于臨床，能夠準確及時監測兒童LN的發生、發展及轉歸。目前LN生物標志物的發現及研究已經進入“組學時代”[36]，展望未來，重要的是在兒童和成人LN縱向合作研究中進一步驗證已經確定的有希望的尿液生物標志物。對于LN的臨床試驗設計也應進一步改進和均質化，以便能夠比較不同研究之間的結果，從而能夠盡快將這些發現向臨床轉化。相信會有越來越多有前景的LN尿液生物標志物被發現，并能夠與常用的血清和組織生物標志物結合，來指導兒童LN的治療及管理。