microRNA調控缺血性腦卒中小膠質細胞激活作用的研究進展

聶晨晨, 袁 潔, 凡勇福, 阮曉迪綜述, 蘇凱奇, 馮曉東,2審校

缺血性腦卒中是全球最常見的死亡與致殘原因,占所有卒中的75%～80%[1]。嚴重影響患者的生存質量。組織型纖溶酶原激活目前雖作為腦缺血損傷公認且有效的治療手段,但其具有治療時間窗短、再通率低等弊端。中樞神經系統固有免疫細胞-小膠質細胞,在腦缺血損傷早期,激活的小膠質細胞起吞噬碎片作用；隨著炎癥反應及炎性細胞的進一步釋放,其被過度激活,進一步加重炎癥反應的發生,引起腦缺血后神經元的損傷、加劇血腦屏障破壞和腦水腫。有研究表明[2]小膠質細胞介導腦缺血損傷的炎癥反應與M1與M2表型極化有關。目前,關于小膠質細胞表型改變的分子機制尚未明確,現有大量研究證實[3,4]microRNA(miRNA)可調控小膠質細胞的激活、表型轉化及炎癥因子的表達。本文將從miRNA調控小膠質細胞激活及表型轉化方面進行介紹,旨在為腦缺血臨床治療開拓新視角。

1 小膠質細胞激活與雙重作用

19世紀末小膠質細胞被稱為桿狀細胞,起源于卵黃囊原始巨噬細胞,其更新依賴于自身增殖與凋亡的偶聯過程,含量約占大腦組織的10%[5],多分布在灰質、海馬體、基底節和嗅皮質中,是唯一一個永久駐留于中樞神經系統中的免疫細胞。小膠質細胞在腦缺血、缺氧環境下快速激活,激活后在釋放嗜神經因子、吞噬有害物質的同時誘導大量促炎因子的釋放。小膠質細胞對腦缺血損傷的保護作用取決于小膠質細胞中M2表型的極化。Choi等[6]研究發現M2型的小膠質細胞條件培養基導致缺血性腦卒中后同側SVZ(側腦室)中NSPCs(神經干細胞)的增殖與分化。在缺血損傷腦內早期注射小膠質細胞有助于M2型小膠質細胞發揮神經抗炎作用。小膠質細胞的M1和M2不同表型之間動態變化,對于腦組織損傷修復的調節起著重要的作用。

小膠質細胞在腦缺血時的損害作用與其過度激活、M1表型極化有關。在腦缺血損傷中,過度激活的小膠質細胞已被證明參與多種疾病中神經炎癥的表達[7]。研究結果顯示[8]通過減少小膠質細胞的表達,增加Bcl-2的表達數量,可提高細胞存活率。Yang等人發現[9]黃芩素通過降低JNK、ERK、p38的磷酸化水平、抑制NF-κB信號通路、降低炎性因子IL-6的釋放,促使小膠質細胞向M2型的轉化,有利于降低炎癥反應。此外還可以通過抑制小膠質細胞M1型的表達,促進PI3K/Akt/mTOR信號通路的磷酸化,抑制細胞自噬。由此可見小膠質細胞的激活可促使細胞自噬、神經元凋亡。一項研究使用[10]時移雙光子成像技術對MOCA大鼠小膠質細胞的激活進行動態監測,其結果顯示小膠質細胞的增多伴隨著血管生成的減少。在腦卒中早期,抑制小膠質細胞的激活,將有助于維持血腦屏障的完整性,其機制涉及炎癥遞質釋放及相關通路的激活、細胞間的相互作用與氧化應激。以上結果均表明抑制小膠質細胞的過度激活及M1表型的轉化有望成為腦缺血損傷治療的有效靶點。

總之,及時抑制小膠質細胞的促炎表型表達可作為腦缺血損傷治療的有效手段。此外,不同表型的極化在腦缺血損傷中具有時空分布特性。在恰當的時期給予干預有助于最大程度發揮小膠質細胞神經保護作用。

2 miRNA調節小膠質細胞在腦缺血損傷中的作用

MicroRNA作為一種長度為18～25個核苷酸的非編碼RNA,通過誘導Dicer復合體降解mRNA或抑制mRNA的表達,從而影響某些轉錄因子、細胞因子的表達[11]。在一項臨床實驗[12]中采用miRNA高通量技術可觀察到腦缺血環境下miRNA的變化,但是miRNA是否能夠成為腦缺血后診斷與治療的重要靶點一直是研究熱點。依據miRNA在小膠質細胞中的具體作用,將miRNA分為:促進小膠質細胞激活及M1型轉化與抑制小膠質細胞激活及M2型轉化兩種。

2.1 正向調控小膠質細胞激活與促使M1轉化

2.1.1 miRNA let-7c-5p miRNA let-7c-5p作為人體最為豐富的miRNA,可通過調節細胞增殖與凋亡參與疾病的病理過程,Jingshu Ni等人[13]發現在BV2小膠質細胞以及脂多糖誘導的小膠質細胞中miRNA let-7c-5p的含量下降,提示活化的小膠質細胞伴隨著Let-7c-5p的含量減少。該研究與MCAO小鼠體內Let-7c-5p的變化一致。當MCAO小鼠腦內過表達let-7c-5p時,腦梗死損傷體積減少,有利于腦缺血損傷的恢復。由此可見miRNA let-7c-5p可作為腦缺血損傷的治療靶點,其機制為miRNA Let-7c-5p靶向結合在凋亡蛋白caspase 3 mRNA的3’-未翻譯區抑制其表達,維持小膠質細胞靜息狀態。

2.1.2 MiRNA-200b 缺血性腦梗死若不及時治療容易誘發腦水腫,不利于患者日后恢復。而大腦神經炎癥因子的釋放是缺血后腦水腫發生的重要機制。已有研究表明miRNA-200b的表達與腦缺血損傷密切相關,其高度上調可促進相關神經炎癥因子釋放。Wen等人[14]證實這一結論,在體內或體外實驗中,注射高滲鹽水能夠通過抑制miR-200b的表達誘導小膠質細胞M2表型極化及減弱TNF-α、IL-1β及小膠質細胞M1標記物(iNOS、CD86)和miR-200b的表達。隨后的熒光素酶報告基因測定Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor4,KLF4)為miRNA-200b在腦缺血損傷小膠質細胞作用中的靶基因。KLF4可在抑制NF-κB活化因子同時與Arg1、Stat6結合,誘發小膠質細胞M2型基因程序[15]。

2.1.3 miR-377 已有研究表明miR-377可成為腦缺血損傷的治療靶點。Fan Y等人[16]發現在腦缺血損傷大鼠側腦室內注射miR-377抑制劑,能夠減少氧剝奪模型(OGD)下小膠質細胞的激活及相關促炎因子的釋放,并且促使血管生成相關細胞的增殖與遷移。隨后他們應用miRNA靶標預測分析證實ERG2、VEGF可作為miR-377的作用靶點,miR-377與EGR2、VEGF的表達水平呈負相關。EGR2[17]通過降低炎癥因子表達量,抑制小膠質細胞活化在調控小膠質細胞介導的免疫反應中發揮著關鍵作用。此外,VEGF作為一種多效性血管生長因子,可誘導M2型小膠質細胞極化。并有研究表明VEGF可作為miR-377的直接靶點誘導血管生成相關細胞的增殖[18]。因而,抑制miR-377可抑制小膠質細胞過度激活、促進血管再生。

2.1.4 miR-3473b Wang X等人[19]發現MCAO小鼠同側皮質、紋狀體中miR-3473b水平顯著增加。這與體外被脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)或OGD激活的小膠質細胞中miR-3437b的水平變化一致。經注射miRNA-3437b抑制劑的小鼠相比對照組而言,大腦同側皮質及紋狀體中的梗死體積顯著減少且神經功能評分得以改善。進一步研究發現SOCS3(細胞因子信號抑制因子3)上存在miR-3437b的結合位點。SOCS3作為細胞因子誘導蛋白,能夠對免疫細胞中細胞因子的信號傳導產生抑制作用[20],尤其針對IL-6炎性家族。因此,miR-3437b可通過靶向抑制SOCS3的表達介導腦缺血損傷后小膠質細胞中的神經炎癥。

2.1.5 miR-155 miR-155與小膠質細胞介導的免疫反應密切相關。最新研究表明[21]miR-155介導小膠質細胞在腦缺血損傷中的炎癥反應,可歸納為以下幾個方面：(1)miR- 155直接作用于SOCS-1(細胞信號抑制因子-1)、SOCS-6和SHIP-1,抑制細胞因子信號的傳導,抑制小膠質細胞活化。其機制為miR-155直接結合到SOCS-1與SHIP中,減弱STAT-3的活性,其中STAT-3是小膠質細胞激活的指標;(2)顯微鏡下觀察在注射miR-155后,血管周圍聚集的小膠質細胞/吞噬細胞減少,提示miR-155抑制活化后小膠質細胞對血管的吞噬作用;(3)調控免疫細胞(小膠質細胞)表型轉化：在miR-155抑制劑注射7 d后,M1表型標志物CD45與CD86的表達下降。而M2型激活因子：IL-10與CD-45的表達上調,IL-10可通過激活CD-45磷酸化,從而負向調控小膠質細胞的激活。因而miRNA-155能夠調控小膠質細胞的分化及抗炎表型的極化。在此基礎上,Wen Y等人[22]用100 mol/L的旋覆花內酯(acetylbritannilactone,ABL)處理BV2細胞后,可消除mi-155的增長。其機制為ABL通過抑制NF-κB、TLR4表達和促進MyD88、SOCS1及I-κB的表達,進而抑制CGD誘導的BV2細胞中炎癥因子的表達。因而,靶向應用MiR-155可為抑制小膠質細胞的過度激活提供新策略。

2.2 負向調控小膠質細胞激活及促使M2型轉化

2.2.1 miRNA203 髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)通過誘發轉錄因子NF-κB、AP-1核轉位,增強宿主細胞對病原體的免疫應答。已研究證明[23]MyD88介導小膠質細胞的神經炎癥。此外,miR-203在病理及生理免疫反應中也起到重要作用。Yanga等人[24]發現在OGD誘導活化的小膠質細胞中,MyD88可作為miR-23調控小膠質細胞釋放炎癥因子的重要靶點,直接調控MyD88轉錄水平的表達,減弱NF-κB、IL-1β等炎性因子的表達活性。過表達miR-203可減少神經炎癥,改善神經元功能。這一發現為腦缺血損傷的治療提供新靶點。

2.2.2 miR-93與miR-27a 白細胞介素-1受體相關激酶(IRAK4)可增強小膠質細胞中NO和TNF-α的釋放,介導炎癥反應的發生。在體內或體外實驗中[25],小膠質細胞中的miR-93水平與IRAK4的表達均呈負相關。ELISA結果顯示,在腦缺血再灌注小鼠體內注射miR-93模擬物容易導致RAK4的蛋白表達量減少,IL-1、TNF-α的釋放減少,抑制神經元凋亡。因此,miR-93可抑制腦缺血再灌注中炎癥因子釋放,抑制缺氧后小膠質細胞的表達。然而,關于IRAK4能否成為miR-93的直接靶點尚不確定。

隨后Lv等[26]對miR-27a是否能夠調控小膠質細胞介導的神經炎癥進行研究,結果發現過表達miR-27a可顯著降低小膠質細胞的炎性因子白介素-6 (IL-6)、白介素-1β (IL-1b)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和一氧化氮(NO)的表達,其機制為miR-27a可直接靶向結合到IRAK4、TLR4的3’非翻譯區,抑制其表達。進一步佐證了IRAK4可作為miRNA對小膠質細胞激活影響的重要靶點的可能性。

2.2.3 miRNA-124 miRNA-124在小膠質細胞中特異性表達,對維持大腦小膠質細胞處于穩定狀態具有重要作用。在缺血缺氧環境下,miR-124通過直接抑制轉錄因子CCAAT/增強結合蛋白-a(C/EBP-a)及其下游靶蛋白pu1,可誘導小膠質細胞從激活狀態變為靜止狀態,減少神經炎性因子的釋放。有研究顯示[27]miRNA-124水平與小膠質細胞介導的神經炎癥呈負相關,在腦缺血損傷大腦內早期注射miRNA-124可增加Arg-1表達,促進小膠質細胞M2型的轉化、提高神經元存活率。且miRNA-124在腦缺血損傷中的表達作用具有區域和時間依賴性,早期注射及持續長時間注射能夠將其神經保護作用發揮到最大。Hamzei等人[28]分別在促炎高峰期之前、之后給予miR-124注射,以此觀察miRNA最佳治療時間窗,其中miR-124在促炎高峰前注射能顯著使激活的小膠質細胞向M2表型轉化,與之前研究結果一致。此外,有研究發現D-4F[29]作為一種具有抗炎作用的載脂蛋白可通過增加體內、體外microRNA-124水平,促進1型糖尿病型腦缺血大鼠的神經功能恢復,其機制為miRNA-124可通過促進小膠質細胞M2型極化、降低基質金屬蛋白酶-9、腫瘤壞死因子-1和toll樣受體-4基因表達,改善神經功能與維持血腦屏障的完整性。因此,在缺血缺氧環境下,miRNA-124可通過結合多個靶點抑制神經炎癥發生、減少神經元凋亡及降低血腦屏障的破壞。

2.2.4 miRNA-1906 在腦缺血損傷中TLR4的表達增多介導小膠質細胞的激活及炎癥介質的釋放(miRNA調控Toll 樣受體4參與神經系統缺血缺氧性損傷的研究進展)。Xu XM等人[30]在體內、體外實驗均發現小膠質細胞中TLR4的表達多伴隨著神經細胞毒性的發生,不利于神經功能的恢復,當體內注射miR-1906激動劑后,TLR4的表達量受到抑制。應用microRNA圖譜確定TLR4為miR-1906的靶向結合位點。此外,在TLR4基因敲除的小鼠中miR-1906的神經保護作用消失。提示miR-1906在腦缺血損傷中的保護作用依賴TLR4的表達。

2.2.5 miR-26b 先前已有研究表明OGD誘導下的BV2小膠質細胞中IL-6表達增多,miR-26b的表達下降,為進一步確定IL-6與miR-26b在腦缺血中的關系,Kang YC等人[31]運用熒光素酶實驗以確定OGD-小膠質細胞與MCAO小鼠小膠質細胞中miR-26b的靶基因,結果表明miR-26b能夠直接結合到IL-6的3’端的非翻譯區,抑制其轉錄,減少大腦神經炎癥與損傷。此外,miR-26b在介導小膠質細胞激活過程中,仍存在許多下游靶基因。進一步研究可為腦缺血治療提供新靶點。

3 小結與展望

綜上所述,miRNA作為一種可同時調控多種通路及蛋白的非編碼RNA,可通過抑制小膠質細胞激活及M1表型極化,從而減少腦缺損傷中神經炎癥及細胞凋亡的發生。但目前為止,miRNA相關抑制劑及模擬物還未在臨床實踐中開展,主要在于miRNA的給藥途徑多為側腦室注射,不易被患者接受。我們應在現有基礎上繼續深入研究,以確保日后臨床上安全及有效實施。由于小膠質細胞表型空間分布特征不夠明確,miRNA的注射時間也有待進一步研究。此外,小膠質細胞的促炎與抗炎表型并非相互對立,探究miRNA維持小膠質細胞表型的穩定狀態可能是未來研究方向。小膠質細胞和星形膠質細胞與周圍環境關系密切,因此探究miRNA在多種小膠質細胞中相互作用機制,可為腦缺血損傷治療提供新靶點。