高分子材料在髓核組織工程中的應用與研究

祝昊，尚暉，張洋，陳瑞，沈天宇，向治成

（湖北醫藥學院附屬太和醫院 脊柱外科，湖北 十堰 442000）

椎間盤退行性病變（intervertebral disc degeneration,IDD）是導致下腰痛的常見原因，全球有80% 以上的人都受到了相關問題的困擾［1］，同時也成為全球致殘和巨大醫療開支的重要原因［2］。腰椎間盤由髓核（nucleus pulposus,NP）、纖 維 環（annulus fibrosus,AF）以 及 終 板（endplate）三部分組成，隨著年齡的增加，椎間盤的組成成分和微觀結構會發生一定的變化，如髓核因結合水的能力降低而收縮變小，進而導致椎間盤在承受負荷時纖維環出現受損或分層，加速椎間盤及其周圍組織的退行性變化，造成嚴重的后果。目前針對這種疾病的治療手段主要有兩種，第一種是通過藥物或其它物理療法進行保守治療，第二種是通過手術的方式進行椎間盤的切除，達到解除壓迫，緩解癥狀的目的。盡管手術方式多樣［3］，但手術會造成自身及相鄰組織的進一步退變，遠期預后不佳［4］。因此，解決退變組織內的炎癥問題［5］，減少功能細胞的損失，恢復細胞外基質含量，才能實現有效的治愈。細胞椎間盤退變的逆轉對脊柱健康有潛在的巨大影響［6］。在這樣的背景下，通過組織工程的手段對已損傷的椎間盤進行修復受到了更多的關注，相關領域的探索、創新也在不斷進行。

高分子材料的應用是組織工程的重要組成，以高分子材料為載體，模仿髓核的理化性質，配合種子細胞、生長因子的研究在近些年取得了較大的進展。目前大多數研究中，高分子材料主要用于構建支架，作為細胞移植的載體。集成3D 生物打印技術制備載細胞腰椎間盤支架也有一定的可行性［7］。本文從高分子材料在治療椎間盤退變的應用上分析，結合近幾年的研究作一個綜述。

1 高分子材料作為支架材料的應用

高分子材料作為移植細胞的載體，可以為植入的細胞提供適宜的生存環境，以保證移植細胞植入后的效果。另外，治療椎間盤退變的組織工程結構必須適應缺氧和炎癥退變的椎間盤微環境［8］。目前常用作載體的高分子材料主要分為天然材料與合成材料兩種，通常結合分子交聯等手段形成互穿聚合物網絡水凝膠［9］。

1.1 天然材料

用于構建髓核支架的天然高分子材料主要有膠原、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉等。由它們參與構成的水凝膠是組織再生的有效結構［10］。天然材料與植入細胞之間可以產生良好的聯系［11］，使其擁有更加廣闊的應用前途。

殼聚糖（chitosan,CH）化學名稱為聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-B-D 葡萄糖，擁有良好的生物官能性和相容性，在體內也有較高的安全性，同時，被證明可以用于增加復合材料的強度［12］。KUANG等［13］利用脫細胞髓核基質與殼聚糖組成的混合水凝膠培養髓核干細胞，發現添加了生長因子的混合水凝膠中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的基因表達得到增強。ADOUNGOTCHODO等［14］在基于殼聚糖的水凝膠中添加了名為Link N的天然肽后，發現補充有LN 的殼聚糖水凝膠可以幫助在椎間盤退化的早期階段恢復NP 的功能。YUAN 等［15］用殼聚糖水凝膠作為在體外構造的組織工程椎間盤的髓核支架，發現其很好地滿足椎間盤的天然結構以及力學的相關要求。ALINEJAD等［16］研究了幾種新型的溫敏性殼聚糖水凝膠，這些新型水凝膠是由CH 與三種膠凝劑（碳酸氫鈉和/或β-甘油磷酸和/或磷酸鹽緩沖液）的不同組合混合而成，通過測量植入的髓核細胞存活率、新陳代謝和蛋白多糖的合成來評估水凝膠的細胞相容性和功能，發現了能更好表現出與人NP 組織相似的力學性能，并能更好地刺激NP 細胞蛋白多糖的合成和保留的溫敏性殼聚糖水凝膠。SCHMITT等［17］選擇10 只椎間盤受損的綿羊，每只均有3個椎間盤受損，采用注射的方式給每只綿羊的2個椎間盤注入裝載脂肪來源干細胞（adiposederived stem cells,ASCs）的殼聚糖羧甲基纖維素水凝膠支架，12 個月后，與未治療的受損IVD 相比，治療后的椎間盤高度穩定，退行性變進展明顯減輕。

透明質酸（hyaluronic acid,HA），又稱糖醛酸、玻尿酸，是一種由雙糖（D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺）基本結構組成的糖胺聚糖，是結締組織、上皮組織、神經組織和天然細胞外基質的主要成分［18］，它的透明質分子具有吸收500 倍體積以上水的能力。RAJAN 等［19］發現利用石墨烯、殼聚糖以及透明質酸制得的復合材料支架，相對于普通透明質酸水凝膠具有更有利于種子細胞存活及分化的膠孔隙率、密度、溶脹等特性。YAMAMOTO 等［20］發現了透明質酸可以通過調節p38 和ERK1/2 通路抑制椎間盤退變，改善椎間盤的炎癥情況。KAZEZIAN 等［21］證明了透明質酸作為一種抗炎分子，通過將椎間盤環境轉變為更多的合成代謝狀態，并通過促進天然椎間盤(intervertebral disc,IVD)基質的產生而起到了抗炎分子的作用。CHEN 等［22］開發了一種光交聯明膠-甲基丙烯酸透明質酸水凝膠用于培養脂肪基質細胞髓核樣分化，發現這種培養條件下的脂肪基質細胞向髓核細胞分化效果良好，大鼠髓核基質明顯增多，椎間盤高度指數明顯升高。MOHD ISA等［23］在椎間盤損傷的大鼠模型中植入透明質酸水凝膠，發現透明質酸可以有效減輕炎癥和疼痛。KIM 等［24］利用多孔聚己內酯及透明質酸水凝膠組建復合的組織工程椎間盤，并將其植入大鼠尾棘5周，觀察到5 周后結構仍然保持完整。

海藻酸鈉（sodium alginate,SA）是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產物，其在醫藥領域用作生物可降解無毒材料［25］，擁有可以在溫和輻射條件下加工的優勢［26］。海藻酸鹽在與生理環境接觸時會凝膠化成更柔軟的結構，從而限制了其在軟組織再生中的潛力，不適合與承重身體部位相關的使用［27］。海藻酸鈉易于陽離子形成凝膠，同時也可以在結構中加入多種有機材料增加其強度，海藻酸鈉中的醛端基可以主導其與明膠的交聯［28］。ERWIN 等［29］利用海藻酸鈉水凝膠在3D 培養基中培養犬的脊索細胞，發現在缺氧的條件下，脊索細胞產生了與體內觀察到的結構高度相似的結構。MIETSCH 等［30］比較了3D微球培養和海藻酸鹽微球，以及不同培養基組成，通過加入人富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）或轉化生長因子（TGF-1）在靜水壓作用下對人間充質干細胞與髓核細胞軟骨分化的影響，發現在適宜因子的體外誘導下，海藻酸鹽在支架的構建中可以發揮出理想的生物學作用。WANG等［31］以藻酸鹽水凝膠為載體，比較不同種子細胞植入后的效應，發現相同條件下軟骨終板來源的干細胞的成骨效應相較于纖維環或髓核來源的干細胞優越。TSUJIMOTO 等［32］發現超純化海藻酸鹽（ultra-purified alginate,UPAL）凝膠與人類IVD 細胞具有生物相容性，并在椎間盤切除術后促進細胞外基質的產生，顯示出足夠的生物力學特性而沒有材料突出。URA 等［33］在椎間盤切除術的動物模型中，植入UPAL 凝膠，證明UPAL 凝膠植入抑制TNF-α 和IL-6 的產生，下調TrkA 的表達，抑制IVD 變性，減少傷害性行為。SUN 等［34］采用全氟三丁胺（perfluorotributylamine,PFTBA）作為海藻酸鹽支架的氧氣調節劑，發現富含PFTBA 的海藻酸鹽可恢復椎間盤高度和細胞外基質含量，促進植入的髓核細胞的增殖。NAQVI 等［35］研究骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）在常氧（20%）和低氧（5%）條件下三維培養時對不同pH 環境［血液（pH 7.4）、健康椎間盤（pH 7.1）、輕度退變椎間盤（pH 6.8）和嚴重退變椎間盤（pH 6.5）］的反應。發現在低于pH 6.8 時，由海藻酸鈉包裹的干細胞增殖出現障礙，細胞不能存活和積累髓核樣基質成分（糖胺聚糖和膠原）。HUDSON 等［36］發現低氧（1%～5%O2）條件下培養三維結構可以增加原代IVD 細胞外基質成分的產生。DU 等［37］將以包裹NP 細胞的海藻酸鈉水凝膠為核心的工程化IVD 植入物在裸鼠皮下植入后，發現隨著時間的推移，顯示出逐漸的組織形成，表現為細胞外基質的沉積和組織以及機械性能的增強。

還有一些天然材料也常應用于髓核的組織工程中。膠原（collagen）是髓核的重要組成成分之一。WANG 等［38］利用戊二醛交聯型膠原構建一種新的人間充質干細胞培養和分化的支架，發現與Ⅰ型膠原相比，Ⅱ型膠原涂層板培養的干細胞表現出了sox-9、Ⅱ型膠原和aggrecan 基因表達的增加。XU 等［39］將髓核細胞封裝在膠原蛋白水解物、明膠和甲基丙烯酸酯（GelMA）組成的光敏水凝膠中，通過調節GelMA 水凝膠濃度觀察不同濃度下髓核細胞增殖、存活的狀態，得到了最佳的水凝膠濃度（5%）。CHOY 等［40］用膠原蛋白和糖胺聚糖（glycosaminoglycans,GAGs）制作了一個雙相支架，并且通過機械測試測得其恢復率（82%～89%）接近原生椎間盤（99%），并且動態剛度和阻尼系數與原生椎間盤相似。CHIK 等［41］以骨髓間充質干細胞和膠原等高分子材料為原料，采用基于模塊的一體化方法構建具有復雜層次結構的多組分脊柱運動節段（spinal motor segmen,SMS），創造了研究組織成熟和功能重塑的三維模型。

通過脫細胞過程獲得的脫細胞材料也可用作支架材料，這項技術的特點是其可以保持關鍵的天然細胞外基質（ECM）成分［42］。WU 等［43］通過脫細胞與凍干、交聯的處理，制備了豬源脫細胞基質作為集成雙相IVD 支架，熒光顯微鏡和掃描電鏡顯示，該支架為AF 和NP 細胞的黏附和增殖提供了合適的三維環境，在保留了大量的膠原蛋白的同時，提供了較好的力學性能。CHAN 等［44］利用脫細胞技術對牛IVD 進行脫細胞處理，構建完整的終板到終板IVD 支架，通過改變化學和物理脫細胞參數，實現了高達70%的內源性細胞的去除，并能夠保存椎間盤的糖胺聚糖含量、膠原纖維結構和機械性能。

1.2 合成材料

目前常用的人工合成材料包括聚乳酸和聚乙醇酸等［44］。聚乳酸（polylactic acid,PLA）又名聚丙交醇，在體內可以降解為無害的乳酸，常用來作為人體的植入物。XIANG 等［45］利用聚乳酸支架共培養間充質干細胞和胎兒髓核細胞，在植入兔椎間盤12 周后，觀察到植入細胞纖維樣表型，附著在聚乳酸-羥基乙酸（polylactic acid-polyglycolic acid,PLGA）支架上時形態正常，說明PLGA 支架提供了可行的生長條件、力學性能和空間結構。KIM 等［46］開發了不同孔徑的多孔聚乳酸-羥基乙酸支架，用于NP 細胞的培養，并研究了孔徑大小對細胞生長和ECM 合成的影響，發現小孔隙內細胞密度高，通過相互連通的孔促進膠原合成和細胞遷移。大孔隙支架細胞增殖和膠原合成較慢。

醫用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）又稱聚環氧乙烷，在一般條件下有著良好的穩定性和溫和性。NGUYEN［47］等合成了一類新型、結構清晰、機械強度可調的聚乙二醇基納米復合水凝膠，壓應力為24.2 MPa，壓縮斷裂應變大于98%，展現了強大的抗壓能力。CHEN 等［48］通過四臂聚乙二醇（PEG-SH）與銀離子溶液的Ag-S 配位作用，合成了一種具有可注射性、自愈性、抗菌、可降解性和高吸水性的PEG 水凝膠，發現其與椎間盤的作用機制完全匹配。JEONG 等［49］以羥基磷灰石（HA-SH）和聚乙二醇乙烯基砜（PEG-VS）大分子單體為原料，制備了8 種不同的水凝膠，并將其作為NP 和AF 細胞體外培養的基質，發現低分子量HA-PEG 水凝膠的NP 和AF 細胞數最高，而低分子量HA-PEG 水凝膠的NP 和AF 細胞數也較高。

其它諸如納米高分子材料等。WAN 等［50］以生物相容性、可剪切性和納米纖維結構為特征的新型自組裝肽水凝膠（self-assembling peptide hydrogel,SAPH），作為髓核組織工程的細胞載體和支架材料，發現用其培養髓核細胞過程中，細胞存活率很高，同時，表型與體內的髓核細胞類似，活細胞群保持穩定。MA 等［51］設計的新型的RADA16-Link N 自組裝肽支架材料，并將其與生物活性基序Link N 直接偶聯，得到了Link N 納米纖維支架材料（LN-NS），發現其能顯著促進植入細胞的黏附與細胞外基質的積累。

2 高分子材料的其它應用

有一些研究嘗試直接采用復合合成材料代替髓核。KHANDAKER［52］等使用電紡纖維固定在硅膠盤上，組成ENAS 盤，對植入ENAS 椎間盤的兔尾進行了離體機械測試，發現ENAS 椎間盤的粘彈性高于硅膠椎間盤，可與人類髓核的粘彈性相媲美。但該法不屬于目前常見的組織工程方法研究范圍，故在這里不作過多的敘述。

3 結語與展望

髓核具有優良的可塑性，其形態可隨脊柱作各種運動時因重心不同而改變，起著類似軸承一樣滾動支撐椎體的作用。在醫用植入材料中，金屬材料應用廣泛，但其在體內的生物相容性與生物降解性仍存在一定的問題。基于水凝膠的新策略可能有助于揭示IVD 退行性疾病的新可能性。高分子材料具有良好的生物相容性，是目前髓核組織工程中用于構建支架材料的常用生物材料，也是目前最受關注的研究對象。膠原、透明質酸、海藻酸鹽等材料制成的水凝膠給種子細胞適宜的生長環境，結合合適的生長轉化因子，可以達到誘導分化的目的，對于控制炎癥、提高椎間盤的含水量、補充細胞外基質以及恢復椎間盤高度有著十分重要的意義；合成材料的創新應用也給研究帶來了更多思路與方向。由于椎間盤特殊的微觀組成及力學特性，需要選擇合適的方式對支架材料進行構建，進一步測量材料的動態性能，以滿足力學強度的要求。在此基礎上，選擇種子細胞及適宜生長因子，最終構建完整的組織工程髓核，實現受累椎間盤的修復再生。目前構建的水凝膠載體多以注射的方式注入椎間盤組織內，雖然已有的研究證明了注射的安全性［53］，但注射造成的纖維環損傷及可能的退變仍然需要關注，除了注射工具的口徑，注射的部位及路徑還需要更多的實踐證據。同時，也需要建立更多的動物模型，進一步探究通過組織工程手段治療椎間盤退行性病變的時機，過早或過晚的干預都達不到預期的效果。目前許多組織工程手段如天然高分子的改性、合成高分子的制備等已廣泛應用于臨床，還有許多技術成果未來將應用于臨床.所以，是否能夠解決患者的疼痛問題應該被重視，疼痛可能來源于多方面，構建疼痛模型，觀察治療效果，也應作為目前研究的重點。