CircRNA鋅指RNA結合蛋白在惡性腫瘤中作用研究進展

劉 浪，王海存，高 欣，劉廣麟，趙俞喬，姜興明

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院 肝膽胰外科， 黑龍江 哈爾濱 150086)

環狀RNA(circular RNA, circRNA)作為一類內源性功能非編碼RNA，是由前體mRNA剪接形成的閉環結構RNA[1]。與線性RNA相比，具有封閉環狀結構的circRNA具有高度的穩定性和對RNA酶的抗性，在各種動物與人類組織和細胞樣本中表現出高度的特異性表達[2]。CircRNAs在多種惡性腫瘤中呈現異常表達并通過靶向調控關鍵基因影響腫瘤的發生發展[3]。環狀RNA鋅指RNA結合蛋白(circular RNA zinc finger RNA binding protein, circRNA-ZFR)在諸多人類惡性腫瘤中異常表達, 并參與調控腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為。本文對circRNA-ZFR在惡性腫瘤中的研究進展予以總結。

1 CircRNA-ZFR概述

CircRNA-ZFR是一種新發現的環狀RNA，定位于人類染色體5p13.3。作為環狀RNA家族的一員，circRNA-ZFR在肝細胞癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等人類惡性腫瘤中呈異常表達，并通過調控腫瘤微環境以及細胞周期等多個方面影響腫瘤的發生發展[4]。機制上，circRNA-ZFR在諸多腫瘤中作為腫瘤抑制因子或致癌基因發揮作用，其作用機制包括充當分子海綿競爭性吸附miRNA進而調控靶基因的表達，以及通過特定的RNA結合域與靶RNA結合蛋白相互作用來形成RNA-蛋白復合物，從而影響人類惡性腫瘤的進程。

2 CircRNA-ZFR與腫瘤

2.1 CircRNA-ZFR與乳腺癌

CircRNA-ZFR在乳腺癌腫瘤組織和腫瘤細胞內呈異常高表達，并且circRNA-ZFR的表達水平與癌腫遠處轉移及臨床分期密切相關；生存曲線分析表明circRNA-ZFR表達水平越高，患者的術后生存時間越短。外源性沉默腫瘤細胞內circRNA-ZFR的表達后能夠顯著下調腫瘤細胞的增殖并誘導細胞凋亡，同時腫瘤細胞的遷移和侵襲能力也受到明顯抑制。CircRNA-ZFR與miR-578以及miR-578與HIF1A(hypoxia-inducible factor 1α)存在相同的結合位點；circRNA-ZFR能夠直接靶向作用于miR-578，進而阻斷miR-578與下游促癌因子HIF1A 3′-UTR的結合，通過上調HIF1A的表達來促進腫瘤細胞的增殖與侵襲遷移并抑制細胞凋亡；并且預先外源性上調miR-578的表達可部分抑制下調circRNA-ZFR對腫瘤細胞惡性生物學行為的促進作用。上述研究結果提示：乳腺癌中異常高表達的circRNA-ZFR通過調控miR-758/HIF1A軸來促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制凋亡發生[5]。

2.2 CircRNA-ZFR與甲狀腺乳頭狀癌

CircRNA-ZFR在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)內呈上調表達，在PTC腫瘤組織和細胞內circRNA-ZFR表達水平明顯升高；并且臨床病理學數據分析結果顯示circRNA-ZFR的異常高表達與癌癥臨床分析呈正相關，高表達circRNA-ZFR組患者的預后相對更差。利用特異性siRNA轉染從而外源性沉默腫瘤細胞SW579和TPC-1內circRNA-ZFR的表達，腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力受到明顯抑制。機制研究結果表明：circRNA-ZFR可通過ceRNA(competitive endogenous RNA)機制內源性吸附miR-1261來下調其表達，導致miR-1261對下游靶基因C8orf4(transcriptional and immune response regulator)3′-UTR的負向作用減弱；并且預先外源性上調靶基因C8orf4的表達后，沉默circRNA-ZFR對腫瘤細胞SW579增殖及侵襲遷移的抑制作用部分減弱。綜上，腫瘤中高表達的circRNA-ZFR通過ceRNA機制調控miR-1261來上調促癌基因C8orf4的表達，進而增強甲狀腺乳頭狀癌的惡性生物學行為[6]。

2.3 CircRNA-ZFR與腎細胞癌

相比于癌旁正常組織，腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)腫瘤組織內circRNA-ZFR呈現明顯的高水平表達；并且RCC腫瘤細胞內circRNA-ZFR同樣為異常上調表達，利用siRNA轉染來外源性沉默RCC腫瘤細胞ACHN與CAKI-1內circRNA-ZFR的表達后，細胞的增殖及侵襲遷移受到明顯抑制。體外細胞實驗及構建luciferase野生型及突變型載體的雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實：circRNA-ZFR通過內源性海綿吸附機制來下調miR-206的表達，進而同趨勢提升miR-206下游靶基因Met的表達水平(阻斷miR-206與Met 3′-UTR間相互作用)，而上調的Met能夠維持促癌基因Wnt3a和β-catenin的高水平表達；同時高表達的circRNA-ZFR可以激活PI3K/AK信號通路并上調通路相關蛋白的表達。上述實驗研究結果表明：腎細胞癌中異常上調表達的circRNA-ZFR通過miR-206/Met軸來激活Wnt/β-catenin及PI3K/AKT信號通路，并影響通路相關蛋白的表達，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等行為，調控腫瘤的發生發展[7]。

2.4 CircRNA-ZFR與膀胱癌

對104例膀胱癌患者的臨床病理學數據分析以及定量檢測發現：circRNA-ZFR在腫瘤組織和腫瘤細胞中異常高表達；circRNA-ZFR的表達水平與腫瘤體積、臨床分期和淋巴結轉移顯著相關，并且高表達circRNA-ZFR患者的總體生存時間更短；相關分析結果指出circRNA-ZFR還可作為膀胱癌患者早期診斷的標志物。外源性下調腫瘤細胞中circRNA-ZFR的表達后，腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱，并且細胞周期被阻滯在G0/G1期。CircRNA-ZFR與miR-377和miR-377與促癌因子ZEB2(zinc finger E-box binding homeobox 2)存在相同的結合位點，雙熒光素酶報告及細胞學實驗證實膀胱癌中異常高表達的circRNA-ZFR可通過ceRNA機制競爭性吸附miR-377，阻斷其與下游靶基因ZEB2的結合進而上調ZEB2的表達，最終發揮促癌效應[8]。

在膀胱癌的另一項研究中：circRNA-ZFR的下調對腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移具有明顯的抑制作用；小鼠模型體內腫瘤的生長速率同樣因circRNA-ZFR的下調呈現減慢的趨勢。進一步研究表明：circRNA-ZFR可內源性競爭吸附miR-545和miR-1270，進而調控下游促癌因子WNT5A的表達(WNT5A作為WNT家族成員，可通過激活Wnt/β-catenin信號通路調控腫瘤細胞的多種惡性生物學行為[9])；外源性上調circRNA-ZFR的表達后，細胞內Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白水平及WNT5A表達水平明顯升高，而miR-545/miR-1270表達水平出現降低。綜上，膀胱癌中異常高表達的circRNA-ZFR可通過miR-545/miR-1270/WNT5A軸激活Wnt/β-catenin信號通路，進而實現對腫瘤的促癌作用[10]。

2.5 CircRNA-ZFR與食管鱗癌

CircRNA-ZFR在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)腫瘤組織和細胞中表達明顯高于癌旁組織和正常細胞；并且circRNA-ZFR的表達水平與癌腫大小、腫瘤侵襲深度及臨床分期密切相關。將過表達circRNA-ZFR的質粒轉染進ECA109細胞后，腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯增強，提示circRNA-ZFR對ESCC腫瘤細胞惡性生物學行為有促進作用。機制上，circRNA-ZFR可作為ceRNA直接靶向吸附miR-377進而阻斷miR-377與下游靶基因血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的結合，通過同向調控細胞中VEGF的表達進一步影響腫瘤的發生發展[11]。綜上,食管鱗癌中過表達的circRNA-ZFR可通過miR-377/VEGF軸促進腫瘤的進展[12]。

2.6 CircRNA-ZFR與宮頸癌

宮頸癌作為全球女性最常見的癌，其高侵襲性和高死亡率威脅著越來越多的女性健康。宮頸癌組織和腫瘤細胞中異常高表達的circRNA-ZFR與腫瘤淋巴結轉移密切相關，并且circRNA-ZFR對宮頸癌患者早期診斷有一定的預測價值。通過轉染siRNA特異性下調SiHa宮頸癌腫瘤細胞中circRNA-ZFR的表達后，腫瘤的細胞增殖、侵襲和遷移能力明顯減弱；此外，由于circRNA-ZFR表達的下調，處于S期的細胞比占顯著下降并且大量細胞被阻滯在G0/G1期。機制上，宮頸癌中過表達的circRNA-ZFR可作為細胞支架，誘導CDK2/cyclin E1和CDK2/SSBP1蛋白復合物的形成進而激活Rb-E2F1通路，通過促進抑癌基因Rb磷酸化以及正向調節E2F1的乙酰化進一步促使細胞發生G1/S期的轉變，同時加速細胞增殖，從而最終實現對宮頸癌的促癌作用[13]。

2.7 CircRNA-ZFR與肝細胞癌

在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的研究中，circRNA-ZFR在腫瘤組織和細胞中明顯高表達，并且與患者不良預后密切相關。外源性下調Huh7腫瘤細胞中circRNA-ZFR的表達后，細胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯下降，表明circRNA-ZFR在HCC中發揮一定的促癌作用。機制研究發現，circRNA-ZFR可海綿吸附miR-3619-5p進而阻斷其與下游促癌基因CTNNB1(catenin beta 1)3′-UTR的結合，通過同向調控HCC腫瘤細胞中CTNNB1的表達來發揮促癌作用[14]。

對30例HCC患者臨床樣本進行的定量檢測發現，circRNA-ZFR在腫瘤組織中表達更高；并且circRNA-ZFR的表達與腫瘤臨床分期和癌腫大小密切相關，但與年齡性別無關。在體外利用siRNA特異性下調HepG2細胞中circRNA-ZFR的表達后，HepG2細胞的集落形成效率明顯降低，細胞凋亡顯著加速。生物信息學預測以及后續實驗證實，肝細胞癌中過表達的circRNA-ZFR可通過ceRNA機制靶向結合miR-511進而阻斷其與下游促癌基因AKT1的結合進一步正向調控AKT1的表達，最終激活AKT1/β-catenin信號通路，促進腫瘤細胞的增殖并抑制細胞發生凋亡[15]。作為MAP激酶信號傳導途徑中關鍵的組成成分，MAP2K1參與調控細胞增殖、分化以及基因轉錄等過程[16]。circRNA-ZFR于HCC腫瘤組織和細胞中異常高表達，過表達circRNA-ZFR后Hep3B的細胞活力以及侵襲遷移速度明顯增強。進一步的研究結果表明，HCC腫瘤細胞中circRNA-ZFR與MAP2K1的表達水平呈負相關，并且circRNA-ZFR可通過互補結合序列靶向作用于MAP2K1；而MAP2K1過表達可顯著抑制上調circRNA-ZFR對腫瘤細胞惡性生物學行為的促進作用[17]。

糖酵解可通過影響腫瘤微環境促進HCC的進展[18]。通過轉染小干擾RNA特異性下調腫瘤細胞中circRNA-ZFR的表達后，circRNA-ZFR的下調顯著降低Huh7細胞的葡萄糖攝取、乳酸生成能力和細胞內ATP含量；Huh7細胞增殖、遷移和侵襲能力由于circRNA-ZFR的下調出現明顯的減弱。數據庫篩選及雙熒光素酶報告實驗進一步確認，circRNA-ZFR與miR-375和miR-375與HMGA2(high mobility group AT-hook 2)存在相同結合位點；circRNA-ZFR通過靶向作用于miR-375來下調其表達，進而阻斷miR-375與下游促癌因子HMGA2的結合；沉默circRNA-ZFR和轉染miR-375 mimics對Huh7細胞葡萄糖攝取、乳酸生成能力的抑制作用在過表達HMGA2后明顯減弱。綜上，過表達的circRNA-ZFR通過內源性競爭吸附miR-375，進而調控促癌因子HMGA2的表達，最終通過促進HCC腫瘤細胞糖酵解途徑實現促癌[19]。

2.8 CircRNA-ZFR與非小細胞肺癌

與癌旁正常組織相比，circRNA-ZFR在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)腫瘤組織中表達更高；并且circRNA-ZFR表達水平與患者不良預后密切相關。細胞功能學實驗結果顯示，circRNA-ZFR在腫瘤細胞中同樣呈異常高表達；外源性沉默腫瘤細胞中circRNA-ZFR的表達后，細胞增殖、侵襲和遷移能力明顯減弱；此外，G1期NSCLC細胞百分比明顯增加，更多的細胞被阻滯在G1/S期的過渡階段。進一步研究指出，circRNA-ZFR可通過ceRNA機制靶向作用于miR-377-5p，阻斷其與下游靶基因NOVA2(NOVA alternative splicing regulator 2)的結合從而上調NOVA2的表達；過表達NOVA2可部分逆轉沉默circRNA-ZFR以及miR-377-5p mimics對NSCLC細胞惡性生物學行為的抑制作用[20]。在體外，利用小干擾RNA特異性下調腫瘤細胞中circRNA-ZFR的表達后，NSCLC腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力由于circRNA-ZFR的下調表現出明顯的減弱。在生物信息學預測的基礎上雙熒光素酶報告實驗證實，circRNA-ZFR借助海綿吸附機制(miR-101-3p/CUL4B信號通路)調控腫瘤細胞的惡性生物學行為[21]。

在NSCLC臨床耐藥性的研究中，低表達circRNA-ZFR的A549細胞在使用順鉑后凋亡增加，提示細胞的順鉑耐藥性下降；注射低表達circRNA-ZFR的A549細胞后，小鼠體內腫瘤的生長速率明顯減慢，對順鉑的耐藥性也發生明顯下降。機制研究結果表明，circRNA-ZFR通過miR-545-3p/CBLL1軸上調CBLL1(cbl proto-oncogene like 1)的表達，進而影響NSCLC腫瘤細胞的順鉑耐藥性[22]。紫杉醇耐藥的NSCLC患者腫瘤組織和細胞中存在異常高表達的circRNA-ZFR；外源性沉默紫杉醇耐藥的NSCLC細胞中，circRNA-ZFR表達后更多的腫瘤細胞停留在G0/G1期，提示細胞周期被阻滯；同時由于circRNA-ZFR的下調，更多的腫瘤細胞發生凋亡。深入研究發現，circRNA-ZFR與miR-195-5p以及miR-195-5p與促癌因子KPNA4(karyopherin subunit alpha 4)存在相同的結合位點；在腫瘤細胞中circRNA-ZFR靶向吸附miR-195-5p并阻斷其與下游靶基因KPNA4的結合；過表達miR-195-5p以及敲低circRNA-ZFR的表達對紫杉醇耐藥NSCLC細胞惡性生物學行為的抑制作用可被過表達的KPNA4部分逆轉[23]。

3 CircRNA-ZFR異常低表達

對48例胃癌(gastric cancer, GC)患者腫瘤組織和細胞的定量檢測結果顯示：circRNA-ZFR在GC腫瘤組織和腫瘤細胞中呈異常低表達；circRNA-ZFR的表達水平與淋巴結轉移及腫瘤臨床分期密切相關。外源性上調circRNA-ZFR的表達后，腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯受抑；而過表達circRNA-ZFR后GC細胞凋亡率顯著升高，并且停留在G1/G0期細胞占比明顯增加。機制研究結果顯示，circRNA-ZFR可海綿性吸附miR-130a/miR-107，通過調節下游抑癌因子PTEN(phosphatase and tensin homolog)的表達進而影響腫瘤細胞增殖、細胞周期和凋亡[24]。結直腸癌的研究中，circRNA-ZFR在腫瘤組織和細胞中呈低表達；顯著減弱細胞增殖和侵襲遷移能力。進一步發現circRNA-ZFR可通過miR-532-3p/FOXO4軸調控結直腸癌的惡性生物學行為[25]。上述研究提示circRNA-ZFR在胃癌與結直腸癌中表達下調并作為抑癌基因發揮作用，這可能與腫瘤間的異質性或腫瘤自身特性有關，具體的原因以及分子機制有待后續進一步深入研究。

4 問題與展望

隨著科學技術的發展，circRNA在人類病理生理過程中的調控作用正逐步被揭示。研究證實circRNA-ZFR在腫瘤發生發展中扮演著極為重要的角色：絕大多數惡性腫瘤中circRNA-ZFR呈異常高表達，并通過多種復雜的調控途徑促進腫瘤的惡性生物學行為；而在胃癌以及結直腸癌中又可充當抑癌因子，對腫瘤增殖和侵襲遷移有一定的抑制作用；同時circRNA-ZFR異常表達又與患者的預后密切相關。然而，對于circRNA-ZFR在不同腫瘤中的差異表達及其在臨床診治中的作用仍有待進一步探索。深入研究circRNA-ZFR在人類腫瘤中的表達及作用機制將有助于惡性腫瘤的診斷、治療和預后評估。