綜 述 線粒體相關內質網膜參與調控腦缺血再灌注損傷的研究進展

錢 軍， 王艷云， 葉群英綜述， 羅紅波審校

缺血性腦卒中是臨床上比較多見的腦血管疾病，根據流行病學調查研究的數據顯示，2019年我國缺血性腦卒中發病率為1700/10萬[1]，占全部腦血管疾病的85%以上，針對缺血性腦卒中，應力爭盡早對缺血的腦組織實施再灌注治療，挽救缺血半暗帶是臨床上首要治療原則，但血流和氧氣的恢復會加重大腦損傷，甚至造成不可逆的損害，這種現象被稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)[2]，CIRI的機制復雜，主要有線粒體能量代謝障礙、鈣離子超載、氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應、興奮性氨基酸毒性、血腦屏障破壞、NO合成過多、細胞焦亡等[3]，線粒體相關內質網膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)是線粒體與內質網(ER)緊密連接但未融合的動態結構，許多研究發現MAM在許多細胞過程中發揮重要作用，如調控Ca2+穩態、線粒體動力學、氧化應激、炎癥反應、脂質代謝、細胞凋亡、自噬等[4]，近年研究發現，MAM參與的細胞事件和腦缺血再灌注后發生大腦損傷的病理生理機制高度重合，因此，了解MAM參與調控腦缺血再灌注損傷的病理生理機制可能成為治療和預防CIRI提供新的方向。本文結合國內外文獻就MAM參與調控腦缺血再灌注損傷的研究進展作一綜述。

1 MAM的概述

內質網和線粒體之間膜接觸的概念最早出現在脂質研究中，Ruby[5]等人用電子顯微鏡觀察到線粒體與內質網之間有開放的通道，并發現有蛋白質從內質網轉移到線粒體。到目前為止，MAM的存在已經通過不同的技術得到證實，包括活體成像、新的電子顯微鏡方法和亞細胞分離等。線粒體相關內質網膜的最佳定義是與線粒體接觸的內質網膜，但兩者接觸部位緊密相連卻不融合。在真核細胞中，線粒體與內質網的相互作用主要由內質網-線粒體接觸復合物(ER and mitochondria encounter structure,ERMES)介導，但在哺乳動物細胞中，線粒體與內質網界面更具有復雜性，兩者之間的聯系不是靜態的，而是隨細胞狀態的不同而動態改變，兩者之間接觸部位的間距在10～30 nm之間波動[6]，接觸總面積在5%～20%之間波動，這種聯系方式使得線粒體與內質網在有聯系的同時又保持各自的特性。有研究表明，在腦缺血再灌注中，線粒體有絲分裂的上調會提供神經保護[7]，Sun[8]等發現通過抑制內質網應激可以減輕腦缺血再灌注損傷，對神經有保護作用，可見MAM在腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用。

線粒體與內質網的動態連接涉及多種蛋白的參與，如電壓依賴性陰離子通道(VDACs)、線粒體融合蛋白1/2(Mfn1/2)、1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)、酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51(PTPIP51)、囊泡相關膜蛋白相關蛋白B(VAPB)、葡萄糖調節蛋白75(GRP75)、PTEN誘導的假定激酶1(PINK1)等[9]。

2 MAM參與調控CIRI的病理進程

2.1 鈣離子穩態 鈣離子穩態是細胞中大部分生化反應的基礎，鈣離子主要在內質網儲存，在線粒體中發揮作用，調節細胞基本功能。鈣離子從內質網轉移到線粒體高度依賴MAM，尤其是MAM所募集的IP3R/Grp75/VDAC構成的Ca2+通道[10]，其中IP3R定位于內質網膜，是ER釋放Ca2+的主要通道之一，電壓依賴性陰離子通道蛋白1 (VDAC1)是位于線粒體外膜(OMM)上的Ca2+通道,葡萄糖調節蛋白75(GRP75)可以將IP3R的配體結構域與VDAC1連接，因此GRP75是連接兩個細胞器兩側兩個蛋白的關鍵分子[10]，VDAC1和IP3R通過與GRP75相互作用，維持內質網與線粒體之間的鈣離子穩態，這是維持線粒體正常功能所必須的。此外，MAM中還存在其他促進ER和線粒體之間Ca2+有效轉移的蛋白質復合物，如VAPB-PTPIP51復合物[9]。研究發現，線粒體與內質網之間緊密接觸的距離可能會影響線粒體功能，當兩者之間的距離<5 nm(通過電子斷層掃描顯示)會促進線粒體的鈣超載導致細胞損傷[11]，這種距離是隨著IP3誘導胞漿中Ca2+的增加而動態變化。綜上所述，MAM通過感應細胞質中鈣離子濃度，可能會動態改變形狀，進而改變組織間距離，以進行合適的細胞反應或信號轉導。另一方面，當線粒體內大量Ca2+長期存在時，會引起線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放，腦缺血再灌注后，MPTP開放會引起線粒體破裂，最終導致細胞死亡，Huang[12]等研究發現羥基紅花黃色素A通過線粒體通透性轉換孔抑制細胞凋亡減輕腦缺血再灌注損傷。在腦缺血再灌注損傷病理進程中，Ca2+超載和細胞凋亡是組織損傷的重要機制，在腦缺血再灌注后，可通過調控MAM募集的蛋白構成的通路減少Ca2+內流，避免Ca2+超載引起的細胞死亡，減輕腦缺血再灌注損傷。

2.2 線粒體動力學 線粒體動力學主要包括線粒體融合、分裂、自噬等。線粒體融合主要通過融合蛋白介導，如融合蛋白1/2(mfn1/2)和Optic atrophy 1(Opa1)，mfn1/2定位于線粒體外膜，Opa1定位線粒體內膜，分別介導線粒體內外膜的融合[13]，其中的mfn1只定位于線粒體，而mfn2不僅定位于線粒體，而且在MAM中大量存在，當線粒體融合增強時，ATP合成增加以及細胞的氧化磷酸化水平上升，能量合成增加，另外，線粒體融合還參與線粒體的合成與受損線粒體的修復。線粒體分裂主要由分裂蛋白調控，如動力蛋白相關蛋白1(DRP1)、裂變蛋白1(FIS1)及線粒體分裂因子(MFF)，其中DRP1主要定位于細胞質，當線粒體分裂時，DRP1被分裂因子募集到線粒體膜上與FIS1結合，DRP1與FIS1的復合體使GTP酶構象發生變化，GTP水解釋放能量，進一步誘導線粒體分裂[14]，DRP1的活性可以被多種蛋白所調控，其中有一種突觸融合蛋白Syntaxin17，據報道該蛋白定位于MAM和線粒體，并確定DRP1在MAM中的定位和活性[15]。線粒體自噬主要是由自噬蛋白，如Bnip3、Nix等所調控，及時消除功能失調的線粒體并保留適當的線粒體數量對于正常的細胞功能和細胞生存是不可或缺的，線粒體自噬被認為是線粒體質量和數量控制的核心機制[16]，自噬的發生首先需要形成自噬體，大量研究表明，自噬體在MAM處形成[17]，同時，線粒體的融合與分裂狀態可維持線粒體自噬的發生。張逸[18]等在對腦缺血再灌注損傷模型大鼠進行研究時，通過檢測大腦缺血組織中的線粒體相關動力蛋白的表達發現，腦缺血再灌注的急性期損傷(1 d)會顯著增加線粒體融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表達，而在腦缺血再灌注長期損傷(7 d)的缺血腦組織中線粒體融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表達水平顯著下降，研究發現，通過干預腦缺血再灌注的急性期損傷和長期損傷中OPA1、Drp1的表達水平，可以減輕腦缺血再灌注損傷，陳運轉[19]等在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中發現，抑制細胞自噬可引起神經元損傷加重,自噬的發生可能對神經細胞發揮保護作用。上述數據表明，MAM在線粒體的融合、分裂、自噬等方面發揮重要作用，同時，線粒體動力學也是腦缺血再灌注損傷的重要機制，通過干預腦缺血再灌注后的線粒體相關動力蛋白的表達以及線粒體自噬可減輕腦缺血再灌注損傷。

2.3 氧化應激 氧化應激是指機體內的氧化與抗氧化的狀態失衡，體內自由基超過正常范圍而導致的組織細胞氧化損傷反應，其中線粒體是自由基產生的主要場所[20]。在MAM上有多個氧化調節劑，其中最常見的是胞質銜接蛋白p66Shc，MAM處可見p66Shc濃度增加，p66Shc是一種介導線粒體活性氧(ROS)生成的氧化還原酶[21]，當發生氧化應激時，MAM蛋白p66Shc被激活，轉位到線粒體，參與了ROS的形成。此外，MAM駐留蛋白Ero1-Lα的水平升高可能會增加ROS的產生和內質網中鈣離子的釋放[22]。另一方面，MAM蛋白p66Shc可以參與導致細胞凋亡的信號通路，因為p66Shc中含有一個額外的N-末端富含脯氨酸的膠原結構域(CC2)，其中含有一個絲氨酸磷酸化位點(Ser36)，該位點對促凋亡非常重要[23]。上述數據說明MAM在氧化應激和細胞凋亡中發揮重要作用，同時氧化應激和細胞凋亡也是造成腦缺血再灌注損傷的重要機制。

2.4 炎癥反應 NLRP3炎癥小體是目前為止唯一被報道與MAM有關的炎癥小體，同時NLRP3也是介導細胞經典焦亡通路的關鍵分子[3]，可被細胞器內的活性氧(ROS)正調控，此外，當線粒體的活性失調時，NLRP3激活受到抑制。在NLRP3未受刺激時，大部分定位于細胞質和內質網，NLRP 3作為固有免疫重要的模式識別受體參與了缺血后的炎癥損傷，NLRP 3炎癥小體不僅能識別外源性病原體，也能夠感知自身內源性危險信號(如缺血再灌注損傷)，是炎癥級聯反應的關鍵分子通路，當發生缺血再灌注損傷時，NLRP3被激活，激活NLRP3進一步激活凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)并與ASC重新定位于MAM，激活的ASC進一步招募pro-caspase-1并將其激活，被激活的caspase-1可以誘導包膜穿孔、死亡，使胞內物質釋放引起炎癥反應，同時促進促炎因子IL-1β、 IL-18成熟分泌[24]，Fann[25]等研究發現腦缺血缺氧后 NLRP3、ASC 及caspase-1等蛋白表達增加，阻斷caspase-1后可減輕腦缺血后的神經損傷。另一方面，MAM還參與神經酰胺的產生[26]，神經酰胺是一種生物活性鞘磷脂，對調節細胞生長停滯、分化、凋亡和炎癥非常重要。以上數據都說明了MAM在炎癥反應中發揮重要作用，同時，炎癥反應也是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一。

3 MAM可能作為腦缺血再灌注損傷潛在的治療靶點

MAM所參與的細胞事件與腦缺血再灌注后發生的病理生理機制高度相關。可以通過抑制MAM上募集的IP3R/Grp75/VDAC鈣離子通路和VAPB-PTPIP51復合物，從而減少缺血再灌注時的鈣離子超載，減輕缺血再灌注損傷，已經有研究發現，通過敲除PTPIP51，可以減少由VAPB-PTPIP51復合物介導的鈣超載，可以大大減輕缺血再灌注后細胞的損傷[27]。如前文所述，MAM所募集的線粒體融合蛋白(mfn)以及定位于MAM上的調控DRP1活性的突觸融合蛋白在線粒體的分裂以及融合中發揮重要作用，可以通過調控MAM上的線粒體融合蛋白(mfn)以及分裂蛋白的調節蛋白等蛋白的表達，進而干預細胞內線粒體的分裂和融合，控制細胞內線粒體的質量和數量，在滿足能量需求的同時，清除損傷的線粒體，減少因線粒體功能障礙引起的缺血再灌注損傷，研究發現，通過上調存在于MAM上的mfn2可促進線粒體生物合成從而抑制細胞凋亡[28]，鹽酸戊乙奎醚可通過線粒體動力學機制對心肌缺血再灌注損傷有較好的保護作用[29]?？梢愿深AMAM蛋白p66Shc的激活和Ero1-Lα的水平，減輕氧化應激對缺血再灌注的損傷，P66Shc的缺失已被證明可以減輕缺血再灌注損傷，然而，p66Shc誘導的ROS的形成也參與了胰島素信號的傳遞，可能參與了抵抗輕度缺血再灌注損傷的內源性防御[30]。還可通過阻斷與MAM相關的NLRP 3炎癥小體的激活，減輕炎癥反應對缺血再灌注的損傷。

綜上所述，MAM可通過多個方面參與腦缺血再灌注損傷的病理進程，調控MAM募集的蛋白的表達，能夠減輕細胞缺血、缺氧引起的氧化應激，保證線粒體的數量和質量，還可干預MAM參與的炎癥反應，均可以減輕缺血再灌注損傷，這為MAM作為腦缺血再灌注損傷治療的潛在靶點提供依據。

4 展 望

線粒體和內質網是細胞中發揮多種功能的細胞器，而MAM作為線粒體與內質網(ER)緊密連接但未融合的動態結構，影響細胞的生命周期，MAM通過調控Ca2+穩態、線粒體動力學、氧化應激、炎癥反應、脂質代謝、細胞凋亡、自噬等多種途徑，決定著細胞的命運。從腦缺血再灌注損傷的機制上分析，MAM的功能與其高度重合。如前文所述，近年來已有研究發現，通過干預MAM所募集的蛋白，可以減輕缺血再灌注損傷，如敲除PTPIP51、上調mfn2的表達等，這都說明MAM可能是治療腦缺血再灌注損傷的靶點。要確定MAM與腦缺血再灌注損傷是否有關系，首先需要明確在發生腦缺血再灌注損傷中患者的MAM是否有異常，如MAM募集的蛋白的表達、線粒體與內質網之間接觸面積的變化等，但由于MAM的組成和功能的復雜性和多樣性，也為量化MAM的水平變化帶來挑戰。目前，MAM仍然有許多有待研究的問題，MAM的研究對探究腦缺血再灌注損傷等疾病的治療靶點具有重要意義。