巨噬細胞在組織工程皮膚再生中的研究進展

楊亞冬 劉興柱 李 平 張文元

目前已經有產品化的組織工程皮膚在臨床上應用，但移植后瘢痕增生明顯，造成修復不理想的情況幾乎都難以避免，尤其是大面積的瘢痕會對患者的生理和心理造成極大的影響，所以對組織工程皮膚移植過程中如何減少瘢痕形成的研究越來越受到關注[1,2]。研究人員期望通過不斷深入了解傷口愈合的生物學特點及關鍵的調控因素，達到人為干預調控機體再生的某些關鍵基因或因子，觸發機體再生的“開關”，使機體缺損的皮膚得到完美再生。越來越多研究證實，巨噬細胞在促進心臟、胰腺、肌肉、神經等多種組織再生中不可或缺，可見巨噬細胞與組織再生有著非常密切的聯系[3～6]。且已證實巨噬細胞是調節傷口愈合和組織修復的關鍵角色，它在細胞纖維化和瘢痕形成過程中發揮重要作用[7]。這為組織器官再生的研究提供了新思路。本文就巨噬細胞在組織工程皮膚再生修復中發揮作用及其研究進展做一綜述。

一、巨噬細胞極化

巨噬細胞是單核-吞噬系統的主要成員之一，廣泛分布在全身組織中，通過直接參與病原體清除或在無菌炎癥條件下修復組織，在維持生物體完整性方面發揮著高度多樣化的作用。在不同刺激因子誘導下巨噬細胞會改變其表型，表現出多樣化功能，此即為巨噬細胞極化。極化后主要可產生兩種亞型：經典活化巨噬細胞(type-1 macrophage, M1)和替代活化巨噬細胞(type-2 macrophage, M2)，每個亞群都有自己的特點和功能[8]。

M1型巨噬細胞是單核細胞表面的Toll樣受體(TLR)與病原體或其產物結合后產生的信號或γ干擾素(IFN-γ)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等細胞因子刺激誘導下分化而來的，并能通過分泌趨化因子[CC趨化因子配體2(CCL2)、CCL3、白細胞介素8(IL-8/CXCL8)等]和促炎性細胞因子[IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等]介導產生炎性反應。M2型巨噬細胞是在IL-4、IL-13、集落刺激因子(CSF-1)等誘導下分化而成，可分泌IL-10、轉化生長因子β(TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等，發揮炎癥抑制作用，參與組織損傷的修復和纖維化[9]。

在機體免疫功能正常情況下M1/M2型巨噬細胞極化保持著平衡，當感染或炎癥嚴重時，巨噬細胞首先表現出M1表型，釋放促炎性細胞因子以對抗刺激，通過氧依賴性以及氧非依賴性殺菌系統發揮清除病原體作用，前者包括反應性氧中間物(ROIs)和反應性氮中間物(RNIs)，后者如溶菌酶、乳鐵蛋白等殺傷系統。但是，如果M1型持續下去，就會造成組織損傷。因此M2型巨噬細胞分泌大量的抑炎性細胞因子抑制炎癥，促進組織修復、重塑、血管新生，保持體內平衡。

二、組織再生修復與巨噬細胞關系

很多人都會有疑問：為何有些低等動物即使斷尾、斷肢都能再生出一個新的，而人類受傷后卻形成瘢痕？目前對于這個疑問大家比較認可的觀點是進化論。當哺乳動物進化出免疫系統后對損傷產生瘢痕反應，肉芽組織覆蓋創面，達到快速愈合目的，使它們免受病原體等其他有害因素再次傷害，而這個代價就是失去了再生能力[10]。那是否意味著哺乳動物體內仍然具有休眠的再生所需的分子和細胞通路？于是有人提出人類的再生可能“只需把開關打開”。有研究者對蠕蟲的基因組進行研究，發現了早期生長反應(early growth response，EGR)這個主控基因，可以通過開啟或關閉其他基因來調控再生等許多生理過程。但是該基因在人類即使能夠開啟，也不能促進再生，研究人員認為基因組間的調控是多層次的，且各物種間是不同的[11]。

目前對于再生的“觸動開關”的研究只是觸及了皮毛，對于這個未知領域，各國研究人員開展了一系列研究，發現不同組織具有各自獨特的再生能力，但巨噬細胞基本都參與了這一過程。有研究證實了巨噬細胞參與了新生小鼠心臟再生過程中的心肌細胞增殖[3]。其修復機制是通過介導巨噬細胞極化和參與抗炎轉化，激活巨噬細胞中TGF-β/Smad信號，調節梗死區心肌的修復和重構[12]。有研究利用急性胰腺炎(AP)小鼠模型檢測急性炎癥到再生階段的胰腺巨噬細胞的動態變化。研究結果顯示，M1型巨噬細胞在AP的促炎期占優勢，而M2型巨噬細胞在胰腺修復/再生期占優勢。再生早期和晚期巨噬細胞的減少分別顯著阻斷了腺泡-導管上皮化生或延遲炎癥消退。巨噬細胞的選擇性激活部分依賴于IL-4RA信號，胰腺巨噬細胞中ECM/AKT的激活促進了組織再生過程中的炎癥消退[4]。

三、巨噬細胞參與皮膚損傷修復過程的研究

要研究消除瘢痕，就要先了解一下傷口修復過程中瘢痕是如何形成的。在皮膚損傷后，受損組織通過協調信號恢復，構成皮膚損傷反應。典型的皮膚損傷反應可分為4個階段，即損害限制期、炎癥期、增殖期和重塑成熟期[13]。其實傷口修復是一個連續的過程，首先血小板、基質纖維纖連蛋白聚集形成血凝塊，暫時抵御病原體入侵，接著單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、角朊細胞等細胞聚集遷移，發揮清除病原體作用，同時在局部釋放各種細胞因子介導炎性反應，此時的巨噬細胞以M1型為主。隨后生長因子促進血管內皮細胞和成纖維細胞的增殖，形成“肉芽組織”，有大量滲出液及炎性細胞聚集，以M2型巨噬細胞為主，包括中性粒細胞及淋巴細胞，因此肉芽組織具有抗感染功能。隨著肉芽組織逐漸成熟重建為纖維結締組織，即瘢痕組織，瘢痕組織會繼續重建，恢復部分功能，但與正常皮膚組織比較，還是有很大差異。與典型的急性傷口愈合過程不同，慢性傷口中M1型和M2型巨噬細胞的轉化是失調的，傷口邊緣80%是M1型巨噬細胞，這是導致慢性傷口持續炎癥并最終形成瘢痕的最大因素[14]。

從上述創面修復過程可以看出：免疫過程貫穿于創傷愈合的整個過程。我們是否可以通過人為地給予相應的刺激因子，誘導巨噬細胞在傷口愈合早期就向促修復和抗炎的M2亞型分化，縮短炎性反應期，使機體的創面發生再生修復而減少瘢痕形成。這個想法在蠑螈斷肢再生過程中得到印證。有研究通過對蠑螈斷肢再生過程用單細胞測序法檢測，發現蠑螈肢體再生早期就出現M2型巨噬細胞，說明M2亞型在斷肢早期出現構成的特異免疫微環境很可能是蠑螈無瘢痕再生的關鍵所在[15]。對免疫信號進行綜合性分析發現，巨噬細胞浸潤是蠑螈肢體再生所必需的。當全身巨噬細胞清除后斷肢傷口發生愈合，但斷肢無法再生，一旦巨噬細胞得到補充后，再截肢就能恢復殘肢的完整再生能力[16]。當然也不能絕對的將巨噬細胞向某個亞型極化，這樣不僅不會觸發再生，可能連最基本的創面愈合都困難了。有研究利用BALB/c重組激活基因(Rag)-2和白細胞介素2受體γ (IL-2Rγ)雙敲除(KO)小鼠研究創面愈合情況，發現KO小鼠先天調節功能喪失時，M1型過度極化、血管生成不良和創面受損加重[17]。所以現在較多創面愈合研究主要集中在調控有助于M2型巨噬細胞極化的因素，減少M1型巨噬細胞產生促炎性細胞因子或表達，使M1和M2兩種亞型達到某種平衡，促進創面再生修復，減少瘢痕形成[18]。

四、組織工程皮膚對巨噬細胞極化的影響研究

組織工程皮膚構建主要有三大要素：種子細胞、支架材料及細胞因子。細胞因子對巨噬細胞極化會產生直接的影響，其他兩個因素是否會對巨噬細胞極化發生影響是研究的重點。

1.種子細胞對巨噬細胞極化的影響研究：在組織工程皮膚中用得最多的種子細胞是間充質干細胞，如骨髓間充質干細胞(bone marrow stem cell, BMSC)、真皮間充質干細胞等，當然還有其他干細胞。間充質干細胞是一類具有多分化潛能的干細胞，還具有良好的增殖能力及免疫調節作用，可通過影響巨噬細胞的極化，來影響局部組織的炎性反應過程。有研究者采用脂多糖刺激體外培養的巨噬細胞分泌炎性細胞因子IL-10和TNF-α，然后在培養體系中加入BMSCs，結果發現加入BMSCs后減少了炎性細胞因子的分泌，提示可能具有促進巨噬細胞向M2型分化的作用[19]。也有報道從動物模型層面對這個現象進行驗證，鄭遠華等研究發現，通過將BMSC經過尾靜脈注射給膿毒癥大鼠模型，可抑制腹腔巨噬細胞向M1型極化，從而減輕膿毒癥大鼠的炎性反應[20]。為了更好地修復皮膚創面，研究人員開始致力于調控損傷皮膚局部環境，使失衡的免疫應答重新達到平衡。Yang等[21]通過姜黃素影響BMSCs的增殖及分泌細胞外基質等功能來調節創面修復的微環境，促進創面修復再生。

2.支架材料對巨噬細胞極化的影響研究：組織工程皮膚中采用的生物材料可能會對巨噬細胞的表型調控產生影響。越來越多的證據表明，巨噬細胞的極化狀態對生物材料的理化性質高度敏感，隨著生物材料研究的發展，研究人員已經能很好地控制材料的表面性質，以介導人體的免疫反應，調節組織的炎癥和修復再生[22]。海藻酸鈉、明膠及膠原已經被大量研究證實可用來治療組織損傷，較多研究采用將纖維蛋白膠與骨髓間充質干細胞復合，制作活性敷料膜，移植修復皮膚缺損動物模型，獲得較好療效。大家認可的機制是生物材料可以募集CXCR4+細胞，包括巨噬細胞、造血干細胞和骨髓間充質干細胞并增加血管生成[23]。據報道生物活性玻璃/海藻酸鈉水凝膠可使巨噬細胞在體內外向M2表型極化，上調抗炎基因的表達。M2型極化后的巨噬細胞可進一步招募成纖維細胞和內皮細胞，增強成纖維細胞的細胞外基質合成和內皮細胞的體內外血管化[24]。根據生物材料理化性能用作細胞支架或藥物遞送系統對巨噬細胞表型進行調控，也許能夠成為一種促進組織再生的治療策略。

五、展 望

綜上所述，皮膚替代品的出現極大緩解了臨床上皮膚缺損治療的難題，加速了傷口愈合，但它們在促進創面再生、減少或抑制瘢痕形成方面還有待于更進一步的優化和研究。干細胞、生長因子以及生物材料的開發為皮膚再生醫學的發展提供了巨大的前景。再生療法的療效很大程度上受宿主免疫系統的影響，而宿主免疫細胞尤其是巨噬細胞在組織修復和再生過程中起著重要的作用。因此，了解巨噬細胞如何影響組織愈合對開發有效的再生策略至關重要。雖然已經有研究通過誘導巨噬細胞向有利于再生的M2型極化以促進創面修復，但是效果并沒有達到預期，所以在未來需要不斷開展深入研究，掌握調節巨噬細胞與其他免疫細胞的協同發揮作用的方法促進組織再生，使組織工程皮膚移植治療在臨床上的應用更加廣泛，減少或消滅瘢痕的形成。