免疫檢查點在乳腺癌中的應用研究進展

嚴峻鋒 邱福銘

乳腺癌是當前世界上女性發病率第一位的惡性腫瘤，2018年，全球有200萬例乳腺癌被確診[1]。隨著腫瘤免疫研究的進展，人們發現免疫逃逸在腫瘤發生、發展方面起關鍵作用。一方面腫瘤細胞能夠通過免疫編輯手段使本身的免疫原性發生改變，從而逃避免疫監視[2]；另一方面腫瘤微環境中的一些因子可以保護腫瘤細胞不被免疫系統識別和殺傷[3]。當前已有多種抗腫瘤免疫機制被發現，如能夠增加免疫系統抗原識別能力的腫瘤疫苗，有補充細胞毒免疫細胞的過繼細胞療法，以及解除T細胞免疫抑制的免疫檢查點抑制治療等。在這些療法中，免疫檢查點抑制治療已在黑色素瘤、腎癌、非小細胞肺癌和其他部分實體腫瘤中取得了顯著的臨床效果[4]。近些年，乳腺癌相關免疫檢查點抑制療法也獲得了極大進步，然而各免疫檢查點的基因表達模式各不相同，不同的免疫檢查點在腫瘤中的治療評估價值也不盡相同。本文對免疫檢查點概況、腫瘤免疫檢查點抑制治療現狀以及乳腺癌相關免疫檢查點的研究與治療應用進展作一綜述。

1 免疫檢查點的概念

健康機體的免疫系統維持在一個動態的平衡，免疫反應過低可增加感染及腫瘤的發生概率，而免疫反應過強則會導致自身免疫系統疾病的發生[5]。通常情況下，那些通過抑制機體免疫反應，控制效應細胞過度激活，避免免疫病理損傷的共抑制分子叫免疫檢查點[6]。免疫檢查點發揮著穩定機體免疫功能，調節對外來抗原免疫應答的強度、幅度、持續時間，防止發生自身免疫系統疾病的重要功能。腫瘤微環境中的一些細胞因子可促進間質內調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）表達免疫檢查點受體，腫瘤細胞也可促進自身免疫檢查點相關配體的表達上調，待配體結合受體，可通過其特定的氨基酸序列激活下游的抑制性磷酸酶從而實現免疫逃逸。通常，在機體免疫執行方面，T細胞發揮著關鍵作用，其能夠被特異性抗原所識別，從而發生活化產生免疫效應，抑制腫瘤患者體內免疫檢查點，解除T細胞免疫抑制，激活機體抗腫瘤免疫反應，已成為殺滅腫瘤細胞的重要有效途徑。

2 腫瘤免疫檢查點抑制治療現狀

一般情況下，免疫檢查點對免疫反應起負調節作用，當免疫細胞持續活化時，其表達升高，從而避免過度傷及正常組織；當免疫檢查點被激活時，免疫細胞被抑制而不能引發細胞毒性反應，腫瘤就是利用這個調節功能來獲得生存優勢[7]。腫瘤的免疫療法即利用免疫檢查點抑制劑降低腫瘤細胞對T細胞的免疫抑制，活化殺傷性T細胞，從而再次使機體具備抗腫瘤免疫功能，由此實現對腫瘤的有效消滅。目前已有4類免疫檢查點抑制劑由美國FDA批準上市：ipilimumab，其可有效抑制細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen4，CTLA-4）；pembrolizumab以及nivolumab，這兩類可有效抑制程序性死亡因子-1（programmed death1，PD-1）；atezolizumab，此類可有效抑制程序性死亡因子配體-1（programmed death ligand1，PD-L1）[5]。ipilimumab 為首個 FDA 批準的靶向CTLA-4的全人源化單抗藥物，可對抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）以及T細胞的活化通路進行干擾，以此解除免疫抑制，是最早批準臨床用于轉移性惡性黑色素瘤治療的藥物。pembrolizumab是第一個獲美國FDA批準的PD-1靶向單抗，在解除T細胞的免疫抑制和恢復抗腫瘤免疫應答方面較現有的其它單抗具有更強的效應。Ribas等[8]發布了一項包含655例晚期黑色素瘤患者使用pembrolizumab的臨床研究結果，顯示其客觀緩解率（objective response rate，ORR）達33%，1年的無進展生存率為35%，總生存期達到了23個月。目前pembrolizumab已被廣泛用于黑色素瘤、肺癌的治療；Rizvi等[9]研究顯示nivolumab在非小細胞肺癌治療過程中的中位起效時間為3.3個月，明顯長于一般化療的療效評價時間；有關atezolizumab的臨床試驗也正在進行中。

3 乳腺癌相關免疫檢查點的研究與治療應用

免疫檢查點抑制劑在治療惡性黑色素瘤以及非小細胞肺癌方面已取得了一定突破，乳腺癌雖然也開始了很多探索性研究，但目前尚無大量臨床應用的經驗。Gaynor等[10]研究發現，乳腺癌組織中存在著大量免疫檢查點。針對不同類型的乳腺癌，免疫檢查點的表達程度也有所不同，如CTLA-4、PD-1在三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）中特異性增高最多，而ADORA2A在激素受體陽性型乳腺癌中最高。在預后價值和療效評價方面，B7-H3 mRNA在乳腺癌中的表達與預后呈負相關，在Luminal型患者中更為明顯，TIGIT在乳腺癌中高表達卻提示預后較好，B7-H3的表達與環磷酰胺療效呈負相關[11]。下面列舉了目前較為熱門的乳腺癌相關免疫檢查點的研究結果及應用進展。

3.1 CTLA-4 CTLA-4主要由活化的T細胞表達，CTLA-4和CD28都能與APC表面的B7分子結合，然而在結合后釋放的效能方面，雙方卻完全相反，CD28與B7分子結合后，可正向調控T細胞活化，CTLA-4與B7分子結合后則會負向調控T細胞活化。CTLA-4抑制T細胞活化的作用機制可能有以下兩種：一是CTLA-4與APC表面的B7配體結合后，通過其胞外域占位效應競爭性抑制CD28共刺激信號；二是通過其胞內的YVKM基序，活化其下游的抑制性酪氨酸磷酸酶-2及蛋白磷酸酶-2A，酪氨酸磷酸酶-2可使CD3ζ鏈發生去磷酸化，導致T細胞受體信號減弱，而蛋白磷酸酶-2A可以使蛋白激酶B去磷酸化[12]。Yu等[13]對130例乳腺癌患者的臨床病理特征與生存情況分析發現，CTLA-4不僅表達在乳腺癌細胞上，在腫瘤間質淋巴細胞上也有表達，兩者總CTLA-4表達高的患者預后更差。

目前用于乳腺癌研究的抗CTLA-4藥物主要有兩種，ipilimumab 和 tremelimumab。McArthur等[14]將 18例乳腺癌患者術前治療分成ipilimumab單藥組，冷凍消融組和聯合治療組，研究發現，與冷凍消融組相比，ipilimumab單藥組的外周血中輔助T細胞1（T helper cell 1，Th1）型細胞因子、Ki-67+CD4+和 CD8+T 細胞、ICOS+CD4+和CD8+T細胞的數量均有顯著升高；對術后標本中腫瘤浸潤淋巴細胞（tumour infiltrating lymphocytes，TILs）進行流式細胞儀分析發現，聯合治療組的Ki-67+效應T細胞/調節T細胞比率明顯高于其他兩組。Vonderheide等[15]通過tremelimumab聯合芳香化酶抑制劑治療26例雌激素受體陽性的進展期乳腺癌患者，結果顯示，患者體內Treg數量減少，ICOS+T細胞數量增加。此外，還有兩項關于轉移性乳腺癌聯合用藥的臨床試驗正在進行當中：ipilimumab聯合信號轉導與轉錄激活因子-3和腫瘤干細胞自我更新抗體的研究[NCT02467361]；組蛋白脫乙酰酶抑制劑聯合nivolumab和ipilimumab在人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）陰性進展期乳腺癌的研究[NCT02453620]。

3.2 PD-1/PD-L1 PD-1為T細胞表面一類發揮著關鍵作用的抑制性調節受體，其與CD28、CTLA-4一樣，皆屬于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，因能促進程序性細胞死亡而得名，能夠被部分因子誘導后表達于部分具有活性的細胞表面，如T細胞、自然殺傷細胞、B細胞與巨噬細胞等。PD-1的細胞內分布著1個免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif，ITIM）和1個免疫受體酪氨酸轉換基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM），ITSM基序通過酪氨酸磷酸酶家族調節磷酸酶的召集，不光抑制細胞外信號調節酶的活化，還對磷脂酰肌醇-3激酶以及絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶的活化進行阻抑[6]。PD-1的配體主要有PD-L1和PD-L2，以PD-L1為主，隸屬Ⅰ型跨膜糖蛋白B7超家族。在細胞分布上，PD-L1和PD-1一致，在卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等人類腫瘤細胞株中表達上調[16]。研究發現，PD-L1可對Treg的分化起促進作用，PD-L1在腫瘤細胞表面的表達量愈高，腫瘤微環境中Treg量隨之愈多，腫瘤細胞生成的相關抑制性因子諸如IL-10、TGF-β等的量隨之愈多。TGF-β能夠反向上調APC表面PD-L1的表達，而APC表面表達的PD-L1又通過釋放抑制性可溶性分子到腫瘤微環境直接抑制T細胞的抗腫瘤作用[17]。相較于Luminal型乳腺癌，PDL1在TNBC以及HER-2陽性乳腺癌內表達顯著偏高，Li等[18]在一項系統回顧和薈萃分析中發現，PD-L1在Luminal型乳腺癌患者的表達率為22.3%，而HER-2陽性患者的表達率為30.4%。Muenst等[19]發現，乳腺癌組織內PD-L1表達與患者預后顯著相關。

目前已用于乳腺癌治療的PD-1/PD-L1單抗藥物主要有 pembrolizumab（MK-3475）、nivolumab（BMS-936 558/MDX-1106）、PDR001、atezolizumab（MPDL3280A）、durvalumab（MEDI4736）。與CTLA-4特異性抗體主要是在外周淋巴器官中抑制T細胞活化的作用不同，PD-1/PD-L1單克隆抗體主要在腫瘤微環境中改善效應T細胞功能，因此，PD-1/PD-L1單抗不良反應小，安全性較好。兩項關于pembrolizumab用于進展期TNBC 的研究 KEYNOTE-086[20]及 KEYNOTE-119[21]均顯示：對于PD-L1陽性復發性TNBC患者，pembrolizumab具備可耐受性與安全性，其療效與PD-L1表達水平呈正相關，在PD-L1陽性組中，pembrolizumab相比化療在總生存上表現更佳。PANACEA研究[22]顯示，抗PD-1治療PD-L1陽性HER-2陽性乳腺癌也有一定的獲益。目前研究PD-1/PD-L1在HER-2陽性乳腺癌中的抑制作用的試驗還包括pembrolizumab聯合trastuzumab 和 pertuzumab[NCT03988036]，pembrolizumab聯合抗HER-2疫苗[NCT03632941]。更進一步的藥物臨床試驗，如 nivolumab[NCT02309177]、durvalumab[NCT02649686]、PDR001[NCT02404441]正在進行中。

3.3 CD39/CD73 CD39是一種細胞外三磷酸腺苷水解酶，正常情況下，CD39主要表達在人和哺乳動物Treg上，主要的功能有抑制炎癥反應、抵抗血小板聚集、調節細胞增殖等。CD73是一種胞外核苷酸酶，廣泛存在于大多數組織，控制著離子交換、體液轉運、血小板凝集、組織耗氧以及毛細血管通透性等多種生理作用。CD39能夠水解細胞外三磷酸腺苷和二磷酸腺苷生成一磷酸腺苷，一磷酸腺苷繼而被CD73分解，生成具備免疫抑制功能的腺苷。腺苷在控制機體天然免疫以及調節性免疫方面，作為效應分子發揮著重要作用，經由結合效應T細胞以及自然殺傷細胞表面的腺苷受體，提升細胞中的環磷酸腺苷，導致CD25上調受抑，由此使得效應T細胞增殖能力變弱，免疫因子生成量下降，自然殺傷細胞活性削弱[23]。可見，CD39-CD73-腺苷通路[24]在免疫應答中發揮著關鍵性調控作用。CD39在大多數實體腫瘤包括頭頸部腫瘤、結直腸癌、肝癌、胃癌等均明顯上調，高表達于慢性淋巴細胞白血病內[25]，然而CD39在乳腺癌上表達情況罕有報道；CD73在正常乳腺和乳腺癌中，均有不同程度的表達，在發生轉移的乳腺癌中該分子的表達及活性明顯升高，其表達程度與腫瘤分級和淋巴結轉移呈正相關，同時負向相關于雌激素受體表達[26]。Allard等[27]發現，CD73在TNBC的表達要高于其它亞型，表達越高預后越差，對化療藥物的耐藥越顯著。

目前，抗CD73單克隆抗體或小分子抑制劑已經在腫瘤小鼠模型中證明其抗腫瘤作用[28]；CD73單抗藥物MEDI9447、IPH5301[29]和選擇性小分子抑制劑AB680[30]也已經進入早期臨床試驗；評估CD73抑制聯合PD-1/PD-L1抑制劑療效的Ⅰ期臨床試驗也正在進行中[NCT02503774]、[NCT02655822]。

3.4 淋巴細胞活化基因-3（Lymphocyte activation gene 3，LAG-3） LAG-3是一種跨膜糖蛋白，隸屬于超級免疫球蛋白家族。和CD4一樣，LAG-3的配體也屬于一類主要組織相容性復合體-Ⅱ（major histocompatibility complex classⅡ，MHC-Ⅱ）類分子，當 LAG-3與MHC-Ⅱ結合后，不但能夠削弱T細胞活性，加速T細胞衰竭，還能調控樹突狀細胞的分化成熟[31]。LAG-3與MHC-Ⅱ類分子的親和能力雖然比CD4高，然而雙方不存在競爭性，雙方功能完全相反，其和CTLA-4、PD-1相同，皆為共抑制因子[32]。LAG-3與MHC-Ⅱ類分子間的作用可以抑制抗原刺激的CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化和增殖，在使用LAG-3單抗阻斷后，包括TNF-α、IFN-γ與IL-2在內的Th1型細胞因子分泌量升高[33]。LAG-3還可通過調控CD4+CD25+Treg的抑制功能間接發揮抑制作用[34]。

IMP321是一種重組的LAG3-Ig融合蛋白，它能夠與活化APC上的MHC-Ⅱ結合，使記憶性CD8+T細胞發生活化，釋放抗腫瘤活性[35]。Brignone等[36]對30例轉移性乳腺癌患者使用紫杉醇聯合IMP321的療效進行研究[NCT00349934]，結果發現實驗組的自然殺傷細胞和細胞毒效應記憶CD8+T細胞的表達明顯上升，90%的患者臨床獲益，僅3例患者在6個月中進展，腫瘤ORR達50%，比對照組明顯高出25%。另一項關于IMP321在激素受體陽性的進展期乳腺癌患者中的IIb期臨床試驗正在進行中[NCT02614833]。其他正在進行的關于LAG-3的乳腺癌臨床研究藥物還包括LAG525[NCT03742349]、INCAGN02385[NCT03538028]、XmAb22841[NCT03849469]和 TSR-033[NCT03250832]。

3.5 T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域-3（T cell Ig and mucin domain 3，TIM-3） TIM-3最初被發現是一類存在于全分化型分泌IFN-γ CD4+Th1和CD8+細胞毒性T細胞的特異標志，進一步研究發現，TIM-3也表達于Treg、單核巨噬細胞以及樹突狀細胞的表面[37]。現已明確的TIM-3配體主要有S型凝聚素半乳凝素-9、癌胚抗原相關細胞黏附分子-1、高遷移率族蛋白B-1。TIM-3的作用機制主要為調控T細胞增生以及細胞因子的分泌，可以直接在CD4+T細胞上表達發揮抑制作用，也可以通過在其他免疫細胞上表達來調節CD4+T細胞的活性[38]，另外，TIM-3同時對骨髓源性抑制細胞的擴增具誘導作用[39]。CD8+T細胞是特異性免疫殺傷腫瘤的主要免疫細胞，腫瘤釋放的TIM-3能夠影響其增殖能力及效應功能來逃避免疫監視[40]。Ndhlovu等[41]研究發現TIM-3也在無活性自然殺傷細胞上表達，通過干擾自然殺傷細胞產生細胞因子的能力及調控其直接殺傷作用來發揮免疫抑制功能。

在乳腺癌中，TIM-3不但可以調控CD8+T細胞的數量，而且發現IL-15能夠利用TIM-3調節腫瘤內CD8+T細胞的抗腫瘤反應[42]。TIM-3不包括任何已知的抑制信號基序，因此相比PD-1和CTLA-4，TIM-3在T細胞抗原受體的信號調節位點不是依賴已知的ITIM[43]，靶向TIM-3能夠使治療的精準度提升，顯著減輕對健康組織的免疫傷害。目前關于抗TIM-3治療腫瘤的研究數據很少，正在進行的抗TIM-3藥物在晚期實體腫瘤患者中的Ⅰ期臨床試驗包括：MBG453[NCT02608268]、TSR-022[NCT02817633]和 INCAGN02390[NCT03652077]，其中可能包括部分乳腺癌患者，最后結果如何尚需等待。

3.6 吲哚胺-2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO） 色氨酸是維持機體細胞增殖以及活化的一類必需氨基酸，IDO是肝外僅有的能夠催化色氨酸沿犬尿酸通路分解代謝的限速酶，目前發現IDO高表達與大腸癌、宮頸癌等腫瘤預后差密切相關，其作用機制與其代謝產物、血管生成有關。目前多個研究已證實IDO與腫瘤微環境的免疫耐受有關，IDO能夠使腫瘤微環境內色氨酸耗盡，直接影響T細胞的活性，同時其代謝物質犬尿氨酸對T細胞凋亡具有誘導作用，IDO還可能通過誘導T細胞向Treg分化或者直接活化成熟的Treg來發揮免疫耐受作用。Chen等[44]的研究發現IDO的代謝產物可以增加乳腺癌的轉移，乳腺癌中IDO表達越高者預后越差，尤其是在TNBC亞組[45]。Isla等[46]發現IDO不只存在于乳腺癌細胞中，也存在于乳腺癌微環境的微泡中，參與癌細胞的遷移以及免疫逃逸。

目前圍繞IDO的表達強度和抗IDO干預反應相關性的臨床試驗仍處于初級階段。Ⅰ期臨床試驗藥物以indoximod為主，indoximod是IDO的競爭性抑制劑，該藥物在乳腺癌中已顯示出單藥活性[47]，并且與多西紫杉醇聯合使用取得了一定療效[NCT01792050][48]。Gu等[49]在4T1乳腺癌模型的試驗中發現，indoximod具有抑制CD4+Foxp3+T抑制細胞擴增和刺激CD8+T效應細胞活化的功能，并能夠與IL-12、GM-CSF協同作用，增強抗腫瘤免疫治療效果。此外，大多數IDO陽性的浸潤性乳腺癌同步表達PD-L1（70%），提示多靶點聯合治療比單一治療可能更有效[50]。indoximod聯合p53抗原的疫苗試驗也正在進行中[NCT01042535][51]。關于IDO抑制劑的Ⅰ期研究還有：BMS-986205、GDC-0919[52]，epacadostat[53]。ECHO202研究結果顯示，在對TNBC進行治療方面，采取epacadostat+pembrolizumab療法，可實現10%的ORR，以及36%的疾病控制率[54]，圍繞BMS-986205+nivolumab[NCT02658890]及 GDC-0919+atezolizumab[NCT02471846]的研究也正處在進行階段。

3.7 B與T細胞弱化因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA） BTLA是一個具有免疫球蛋白樣構造的共抑制性分子，同屬CD28家族。BTLA的胞質區包含一個與CTLA-4、PD-1一樣的ITIM和ITSM，可負向調節外周免疫耐受與應答。BTLA結合自身配體后，產生負性免疫調節作用。靜息狀態下，BTLA高表達于B細胞上，但低表達于T細胞、pDC、KT細胞與自然殺傷細胞上，激活后，BTLA在B細胞上表達下降而在T細胞中呈上升趨勢，尤其是Th1細胞，這是一種反向相互作用[55]。BTLA對T細胞存活雖然具備維持作用，但會減少其增殖和活性，從而促進外周免疫耐受，限制抗腫瘤免疫[56]。BTLA還可與其它共抑制性分子如PD-1、TIM-3等協同抑制T細胞功能[57]。因此，它被認為是一種T細胞抑制性受體[58]。多項研究發現，BTLA在1型糖尿病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、腎移植等慢性疾病中具有重要的免疫調節作用，由此推測，BTLA在機體免疫應答中有控制免疫反應時間的長短的作用，對免疫應答起精細調節，這種調節在維持外周耐受中的作用可能較CTLA-4及PD-1更有意義。

關于于乳腺癌，BTLA僅見少量基因層面的研究，Fu等[59]對592例黑龍江省的惡性乳腺癌患者的BTLA基因型多態性關聯性分析，得出5種基因型與乳腺癌的部分臨床病理參數相關。Curtis等[60]對2 000例乳腺癌基因和轉錄組分析后顯示，在高ZBTB16水平患者群中，高BTLA表達的患者預后更差。

4 小結與展望

免疫療法是否有效取決于該腫瘤是否具有免疫原性，乳腺癌能引起免疫反應的依據主要有以下幾點：（1）乳腺癌微環境中存在著大量TILs；（2）癌細胞中免疫相關基因表達和乳腺癌預后相關；（3）基因不穩定性導致突變增加，產生許多新抗原[61]。HER-2陽性乳腺癌和TNBC已被確認為最具免疫原性乳腺癌亞型，是最有可能通過免疫療法獲益的乳腺癌分子分型。atezolizumab已被批準用于治療TNBC[62-63]，而針對HER-2陽性乳腺癌的PANACEA研究[22]也顯示了潛在的良好效果。目前還沒有確切證據表明TILs在激素受體陽性乳腺癌中的表達[64]，故Luminal型乳腺癌能否在免疫治療中獲益及獲益的程度需進一步的研究來探討。

因免疫反應具有記憶功能，故同當前主流的抗腫瘤療法相比，免疫療法的作用時間更持久，更適合于晚期腫瘤或經各種輔助治療后又復發的患者，已在多種腫瘤類型中顯示了較好的優勢，將來有可能發展成為一種不良反應小，且更有針對性的消除殘留腫瘤細胞的方法。免疫檢查點抑制治療在乳腺癌中仍處于初始階段，其他腫瘤已取得的獲益在乳腺癌中是否同樣存在仍有爭議，其中CTLA-4與PD-1/PD-L1抑制劑在乳腺癌上的治療效果已具備確切性，更多免疫檢查點抑制劑新型藥物也正在進行臨床研究。另外，因腫瘤同免疫系統雙方相互作用的復雜程度，單一靶點藥物治療效果有限，多靶點聯合治療策略或許可以更徹底解除抗免疫抑制，提高免疫反應率[61]。聯合多個免疫療法以及免疫療法與化療、放療或靶向治療的結合療法，已經初見成效。在不斷發掘新靶點的同時，檢驗哪些療法的組合可以產生最大的臨床效益，以及研發合適的生物標志物來預測腫瘤對這些治療策略的反應性是今后研究的另一個重點。