分子檢測在細胞學不確定甲狀腺結節診治中的應用研究進展

傅曉鳳 司星 董荷琴 朱江

近年來，甲狀腺癌的發病率在全球范圍內不斷上升[1]。目前，超聲檢查是各國甲狀腺協會指南推薦的甲狀腺非侵入性檢查首選方法[2]，超聲引導下細針穿刺活檢（fine-needle aspiration,FNA）因具備較高的靈敏度和特異度，已作為甲狀腺結節術前診斷的有效手段被廣泛應用于臨床實踐。盡管如此，仍有大約20%～30%的甲狀腺結節因為缺乏特征性的細胞學征象而導致誤診或者不能明確診斷[3-4]。根據Bethesda系統，這些細胞學不確定（indeterminate cytology,IC）結節主要分為3類：意義不明確的細胞不典型病變/意義不明確的濾泡性病變（atypia cells of undetermined significance/follicular lesions of unknown significance,AUS/FLUS）、濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤（follicular neoplasm/suspicious follicular neoplasm,FN/SFN）、可疑惡性腫瘤（suspicious malignancy,SM）[5]。這3類患者多數會被推薦進行再次FNA或者甲狀腺診斷手術，導致部分良性甲狀腺結節患者經歷不必要的手術，同時面臨手術并發癥的風險；另外，對于許多甲狀腺癌的患者來說，診斷性手術無疑是一種不理想術式，具有需要二次甲狀腺切除手術的風險。所以，對于診斷為IC結節的患者，在術前對其良惡性及風險程度作出精準診斷至關重要，這樣可以優化手術方式和術后管理方案，最大限度地減少過度治療，降低醫療成本。然而，僅通過目前的超聲檢查及FNA等常用診斷工具不能夠滿足臨床及患者的需求，因此，甲狀腺結節的精確診斷及分層管理仍是一個亟待解決的臨床問題。2015年，美國甲狀腺協會以及其他臨床內分泌學團體肯定了分子檢測在甲狀腺結節診斷中的的作用，建議當甲狀腺結節術前FNA無法確診時，可以使用分子檢測進行補充診斷[6]。目前分子檢測技術層出不窮，但這些分子檢測方法的效能是否能提高診斷準確性并幫助患者制定個性化的治療方案是當前臨床較為困惑的問題。現就多種甲狀腺結節分子檢測工具及應用研究進展作一綜述。

1 甲狀腺分子標志物的研究進展

在過去的幾十年里，研究者們對甲狀腺癌遺傳機制的深入理解及高通量基因型分析技術的應用，使得甲狀腺癌分子標志物的研究有了顯著的進展，許多甲狀腺癌基因驅動事件被發現。

20世紀90年代，研究者們首次證實甲狀腺結節FNA樣本可提供足夠數量的細胞用于檢測單個點突變[7]或基因融合[8]，21世紀初BRAF基因突變的發現使得單基因突變標志物檢測達到臨床應用的水平[9]。最常見的BRAF V600E突變對甲狀腺癌尤其是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）的鑒別具有很高的特異度及陽性預測值[10]。盡管如此，鑒于腫瘤的異質性，許多甲狀腺癌是由其他基因突變所驅動，僅對BRAF進行檢測無法提供足夠高的陰性預測值。突變基因panel的開發則提高了分子檢測的靈敏度。Nikiforov等[11]設計了7基因panel（包括BRAF V600E、HRAS、KRAS、NRAS、PAX8/PPARG、RET/PTC1、RET/PTC3）用于檢測IC結節，結果表明該panel顯著提高了甲狀腺癌診斷準確性。近年來，基于微陣列芯片技術、下一代測序（next-generation sequencing,NGS）技術的腫瘤研究和臨床實踐的分子檢測正在迅速發展，為甲狀腺結節的精確診斷及分層管理迎來新的機遇。

2 分子標志物檢測技術

2.1 基于基因表達檢測

2.1.1 Afirma基因表達分類器（gene expression classifier,GEC）檢測 Afirma GEC基于微陣列芯片分析技術對167個基因的轉錄物表達水平進行檢測，包括用于鑒別結節良、惡性的142種基因及用于篩選罕見腫瘤（例如嗜酸細胞性腫瘤、轉移性甲狀腺癌等）的25種基因[12-13]，檢測結果報告為“良性”或“可疑惡性”。Alexander等[13]應用Afirma GEC對分類為AUS/FLUS、FN/SFN的IC結節進行診斷，其靈敏度達0.90，陰性預測值為0.94～0.95，而特異度為0.49～0.53。因此，Afirma GEC可作為“rule-out”檢驗用于識別IC結節中的良性結節。相比之下，Afirma GEC陽性患者惡性腫瘤概率僅37%～38%，所以尚不適用于確診甲狀腺癌。而Papoian等[14]研究提出，具有癌癥高風險因素的IC結節（如同時患有橋本甲狀腺炎）的患者在接受Afirma GEC結果時要謹慎，該研究中71%Afirma GEC陰性患者經病理檢查證實為甲狀腺癌，研究者認為使用該檢測手段很可能影響患者對結節的及時干預。此外，有研究指出Hürthle細胞優勢結節在Afirma GEC測試中具有較高的假陽性率，報告為“可疑惡性”結節的實際惡性風險較低[15]。因此，Afirma GEC在不同人群中的實用性是有限的，在選擇時應綜合考慮。

2.1.2 Afirma基因測序分類器（gene sequencing classifier,GSC）檢測 Afirma GSC檢測利用生物信息分析和機器學習策略評估共10 196個基因的RNA表達水平、細胞核及線粒體RNA轉錄水平及基因組拷貝數的變化。除此之外，針對特定和罕見的患者亞組并進一步提高檢測分類性能，Afirma GSC系統還加入了其他7個組分：甲狀旁腺分類器、甲狀腺髓樣癌分類器、BRAF V600E及RET/PTC1和RET/PTC3融合檢測、濾泡含量指數、Hürthle細胞指數和Hürthle腫瘤指數分類器[16]。一項前瞻性、大樣本、多中心的研究結果顯示Afirma GSC診斷BethesdaⅢ/Ⅳ類結節的靈敏度為0.91，特異度為 0.68，其特異度較 Afirma GEC（0.50）顯著提高，這表明至少多1/3以上的患者使用Afirma GSC檢測可獲得良性結果，提示更多的患者可采取主動觀察策略，而非診斷性手術[16]。另有研究表明，在診斷Hürthle細胞病變結節中，Afirma GSC的良性呼叫率（benign call rate,BCR）顯著高于GEC（88.8%對25.7%，P＜0.01），采用GSC檢測使IC結節的手術干預率下降了66.4%[17]。總的來說，Afirma GSC是一種性能更佳的“rule-out”測試，在保持高靈敏度和陰性預測值的同時具有高特異度和陽性預測值，且在評估Hürthle細胞病變結節中更具優勢。

2.1.3 Afirma Xpression Atlas檢測 目前，在甲狀腺IC結節中，Afirma GSC報告“陰性”的結節（癌癥風險約4%）可以考慮臨床觀察而非行診斷性手術；而Afirma GSC報告“陽性”的結節（癌癥風險約50%）通常需要考慮手術治療[17-18]。因此，為進一步確定結節的惡性風險，Veracyte公司最早于2018年3月推出Afirma Xpression Atlas(XA)檢測方法，采用全RNA測序技術檢測基因突變與融合。2020年3月更新的Afirma XA主要檢測593個甲狀腺癌相關基因的905種突變和235種融合，包括104個新鑒定或罕見的基因融合位點，這些位點均含靶向特異性激酶抑制劑[19]。一項大樣本研究應用Afirma XA檢測Afima GSC可疑BethesdaⅢ/ⅣFNAs、BethesdaⅤ、BethesdaⅥ FNAs及 MTC 分類器陽性FNAs，結果顯示44%、64%、87%及70%的結節存在至少1處基因突變或融合，這或將進一步優化患者個性化治療方案，包括靶向藥物的應用[20]。最新研究數據表明，Afirma XA可能為可疑AUS/FLUS、SFN、SM和惡性結節及甲狀腺癌轉移患者提供關于腫瘤組織學、臨床特征、癌癥行為（包括轉移模式）、預后相關預測，并且在適當的臨床環境中對患者靶向治療的選擇具有潛在幫助[20-21]。

2.2 基于基因突變、基因融合檢測 NGS又稱高通量核苷酸測序技術，因其技術成熟、費用低及實驗周期短等特點，已被廣泛應用于科學研究和疾病的臨床診斷中。對于甲狀腺結節，NGS可以利用FNA獲得的細胞進行大規模基因組序列的測定。

2.2.1 ThyroSeq v2.0 有研究基于NGS技術設計了ThyroSeq v2.0基因包，用于檢測甲狀腺癌相關的14個基因的點突變和小的插入/缺失，42種類型的基因融合以及16個基因表達水平，它不僅用于甲狀腺乳頭狀癌的檢測，還包括對甲狀腺髓樣癌和甲狀旁腺疾病的檢測[22-23]。一項回顧性和前瞻性隊列的研究[23]應用ThyroSeq v2.0檢測FN/SFN結節的綜合靈敏度、特異度、陰性預測值、陽性預測值分別為0.90、0.93、0.83、0.96，準確度為0.92，提示該檢測可對FN/SFN進行有效分層并能優化對患者的管理，盡管其中4例病理檢查結果為惡性的結節未檢出任何突變，但進一步評估發現這些結節均不具有侵襲性組織學特征，因此，在排除結節超聲高風險特征和既往放射暴露史或甲狀腺癌家族史等前提下，利用ThyroSeq v2.0對結節進行檢測，未檢出突變者可提示臨床優先選擇主動監測。此外，若ThyroSeq v2.0診斷結節存在低水平突變但不足以診斷為陽性時則需要密切的隨訪、再次FNA或再次分子檢測以監測突變克隆在結節內的發展。一項多機構研究分析發現，ThyroSeq v2.0診斷BethesdaⅢ/Ⅳ類結節的陽性預測值不穩定且低于預期，這取決于惡性腫瘤患病率的差異或者病理學家對非侵襲性腫瘤突變的解釋，提示ThyroSeq v2.0的性能或因臨床實踐環境的不同而異[24]。

2.2.2 ThyroSeq v3.0 根據近年來在不同類型甲狀腺癌中新的驅動突變和基因融合的發現，ThyroSeq v3.0通過擴大現有檢測、納入新的分子標記物以進一步提高診斷效能。該檢測采用DNA和RNA靶向NGS技術分析了112種甲狀腺癌相關基因突變，120余種類型的基因融合，19個異常的基因表達變異以及FNA樣本中的10個基因組區域和組織樣本中多達27個基因組區域的拷貝數變異[25]。用于ThyroSeq v3.0檢測的樣本可以是核酸保存液中的新鮮甲狀腺FNA樣本，也可以是甲醛固定-石蠟包埋的甲狀腺組織[26]。在一項雙盲的前瞻性多中心隊列研究中，ThyroSeq v3.0對BethesdaⅢ/Ⅳ類結節的檢測顯示出高靈敏度（0.94）和陰性預測值（0.97），以及較高的特異度（0.82）和陽性預測值（0.66），使多達61%患者避免診斷性手術，且有助于為檢測結果陽性的患者制定個性化治療方案，這使研究結果得到了進一步的驗證[25，27]。此外，ThyroSeq v3.0還致力于在Hürthle細胞病變甲狀腺結節中實現穩健的測試效能，研究結果顯示ThyroSeq v3.0檢測Hürthle細胞病變結節的靈敏度達0.929，特異度為0.693[25]。

2.3 基于miRNA檢測 miRNA是長度約19～23個核苷酸的單鏈非編碼小型RNA片段，通過干擾蛋白表達參與增殖分化和凋亡調控，導致翻譯抑制或靶點降解和基因沉默[28-29]。越來越多證據表明，miRNA的失調與癌癥相關，包括甲狀腺癌[30-31]。

2.3.1 ThyraMIR/ThyGenX（MPT） 有研究表明，結合基因突變和miRNA分析可以提高甲狀腺病變的檢測[32]，MPT正是基于該優勢構建的一個商業化檢測模型[33]。通常MPT檢測分為兩步，一是ThyGenX通過靶向NGS檢測與甲狀腺病變相關的5個基因突變（BRAF、KRAS、HRAS、NRAS、PIK3CA）和 3 種常見的基因融合（RET/PTC1、RET/PTC3、PAX8/PPARG），結節攜帶 BRAF突變，RET/PTC1、RET/PTC3基因融合時幾乎100%提示PTC可能，提示臨床選擇甲狀腺全切手術作為首選術式。當ThyGenX檢測陰性或僅檢測到RAS、PIK3CA突變及PAX8/PPARG基因融合時，則引入ThyraMIR，該檢測通過實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測10個代表性miRNA的表達水平，并采用專有算法將結節劃分為高、低風險[34]。一項多中心橫斷面隊列研究顯示[33]，在ThyGenX檢測陰性時，ThyraMIR檢測準確地診斷了64%惡性患者和98%良性患者，MPT診斷 AUS/FLUS、FN/SFN的靈敏度和特異度分別為0.89、0.85，有效提高了良性結節的檢出率，并將診斷性手術率降低了69%，這提示MPT多平臺聯合檢測可提高分子細胞學診斷率，進一步完善甲狀腺IC結節的術前風險評估和管理。

2.3.2 ThyraMIR/ThyGeNEXT（MPTX） MTPX 檢測包括ThyGeNEXT突變panel和ThyraMIR miRNA風險分類器檢測。與ThyraGenX相比，ThyGeNEXT擴大檢測了TERT和RET原癌基因突變（提示結節侵襲性），PTEN、GNAS基因突變檢測以及更新的可能作為治療靶點的融合突變位點，即NTRK和ALK融合。MPTX檢測結果包括MPTX測試狀態（陰性或陽性）和臨床風險分類（低、中、高風險）[35]。一項雙盲、多中心的研究結果表明MPTX診斷BethesdaⅢ/Ⅳ類結節的靈敏度為0.95，特異度為0.90，陰性預測值為0.97，陽性預測值為0.75[36]。Sistrunk等[35]對140例AUS/FLUS或FN/SFN患者進行MPTX檢測：MPTX測試陰性和低風險結果提示患者保持無癌生存的概率達94%；MPTX陽性和中風險是提示惡性的重要危險因素，惡性概率均為53%；MPTX高風險提示惡性腫瘤風險增加，概率為70%。以上證據均表明MPTX檢測可提高IC結節的診斷準確率并預示潛在的侵襲風險。MPTX對風險類別的進一步分類提高了該檢測的臨床實用性。

2.3.3 RosettaGX Reveal RosettaGX Reveal甲狀腺分類器通過檢測24個miRNAs的表達將IC結節分類為良性、可疑惡性或髓樣癌。最早的多中心盲法驗證隊列來自Lithwick-Yanai等[37]，在189例細胞學診斷為AUS/FLUS、FN/SFN 的結節中，RosettaGX Reveal檢測的靈敏度為0.85，特異度為0.72，陰性預測值為0.91，陽性預測值為0.59。一項回顧性三機構研究中，Walts等[38]比較了81個IC結節中RosettaGX Reveal和Afirma GEC的表現，與組織學隨訪結果相比，Reveal總體分類準確率為64.2%，Afirma GEC為28.4%，此外，在26個良性 Hürthle細胞病變的分類應用中，Reveal表現也優于Afirma GEC。RosettaGX Reveal可直接利用染色后的細胞學涂片進行RNA檢測，不要求采用新鮮組織或特殊的采集、保存和運輸條件。

3 總結

甲狀腺IC結節的診療是臨床工作中一大難點，相關的分子檢測目前正迅速發展，從單基因檢測、多基因panel突變分析到結合基因融合、microRNAs、基因拷貝數變異等，均顯示了檢測方法的多樣性。本文綜述了各類分子檢測方法及其性能特征的差異，有助于患者及醫生根據臨床實踐環境做出合適的選擇并制定個性化的治療方案。現有的臨床研究數據表明分子檢測在降低甲狀腺結節診斷的不確定性方面有巨大的應用前景。然而，檢測結果良性的甲狀腺結節仍需要長期隨訪以評估這些檢測方法的假陰性率。此外，各類分子檢測只提示結節良、惡性的可能性以及風險程度，對于其結果的解釋及結節的管理還應綜合超聲檢查、細胞學檢查、臨床評估等。目前的研究多為回顧性研究，今后需要開展更多的前瞻性、多機構中心聯合的研究，以進一步了解這些分子檢測方法的性能及臨床效用，發展更個性化的甲狀腺結節診斷和管理策略。