抗疫病加工型辣椒細胞質雄性不育恢復系的創制

李怡斐，楊小苗，王春萍，段敏杰，黃任中，張世才*

(1 重慶市農業科學院蔬菜花卉研究所，重慶 401329；2 重慶市農業科學院生物技術研究所，逆境農業研究重慶市市級重點實驗室，重慶 401329)

辣椒(CapsicumannuumL.)是世界上廣泛種植的一種作物，可作為蔬菜、香料、食用色素和醫藥用途。2020年全球辣椒種植面積達161.5萬hm2，產量達415.7萬t(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)。在過去的30年里，朝天椒消費量增長了40倍[1]。目前辣椒雜交種生產主要依靠人工去雄和授粉，不僅生產成本高，種子純度也難以保障。CMS三系雜交制種具有節約去雄成本、保證雜交種純度、制種產量高和保護品種知識產權等優點。

近年來，國內外學者致力于辣椒CMS恢復系分子標記輔助育種研究，已基于RAPD、AFLP和序列同源性開發了幾個可以預測恢復基因Rf表型的分子標記[2-6]。Gulyas等[7]將RAPD標記OPT-02/570轉成與Rf緊密連鎖的CRF-SCAR標記，遺傳距離為5.3 cM。Kim等[3]將AFRF8轉化為CAPS標記AFRF8CAPS，遺傳距離為1.8 cM。Lee等[5]確定了與CMS育性恢復相關的部分恢復(pr)位點，開發了與該位點密切連鎖的CAPS標記(PR-CAPS)(距Rf1.8 cM)。與Rf緊密連鎖的分子標記可有效提高篩選CMS恢復系的效率，在苗期即可取葉片進行PCR鑒定，不受季節的影響。

目前，由辣椒疫霉(phytophthoracapsici)引起的疫病已成為國內外辣椒主產區最具破壞性的病害之一，每年造成超過1億美元的經濟損失[8]。在強降雨、過度灌溉、排水不暢等條件下更容易引起辣椒疫病發生[9-10]。迄今為止，除化學防治外尚未有有效和安全的措施防治疫病[11-13]。因此，利用抗病品種已成為解決辣椒疫病發生的簡單、有效、安全的途徑。植物育種家也把重點放在培育高抗性品種上。Quirin等[14]開發了一個與辣椒疫病緊密連鎖的SCAR分子標記FQ01/RQ01。李怡斐等[15]利用SLAF-seq構建了辣椒高密度遺傳圖譜，該圖譜包含12個連鎖群，5 565個標記，并對疫病抗性進行了QTL定位。這些為分子標記的開發以及利用MAS培育抗病品種提供了技術支撐。

當前，花藥培養技術可以更快速、更節約地創制性狀純合的育種(純)系，大大減少創制育種純系所需的世代數，從而降低育種工作的成本[16]。近年來，國內外科研工作者通過花藥培養技術獲得了一批DH系。Cabuk等[17]以辣椒Clrgalan和P1(抗疫病)BC2F2為供試親本進行辣椒花藥培養，結合分子標記輔助選擇獲得25個抗疫病的辣椒純系。李怡斐等[18]采用花藥培養技術與MAS技術相結合的方法創制了3個性狀優良的加工型辣椒CMS恢復系。隨后，李怡斐等[19]利用花藥培養技術與MAS相結合的方法創制了14個抗疫病雙單倍體(doubled haploid，DH)株系。重慶位于中國西南地區，夏季高溫多雨天氣容易誘發辣椒疫病大面積爆發，為了更好地解決制種純度和辣椒疫病問題，培育抗疫病的CMS恢復系就成為是解決該問題的唯一方法。

本研究為創制抗疫病加工型辣椒CMS恢復系材料，以長果、單生朝天椒作母本，以抗疫病恢復系為父本，利用雜交、花藥培養和MAS相結合的方法，開展抗疫病CMS恢復系的創制，以期獲得單生、長果的抗疫病CMS恢復系，為利用三系配套選育加工型辣椒抗病新品種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本課題組選用抗疫病恢復系939-1和1021(1)-1為抗疫病和恢復基因供體親本，以長果、單生自交系481-4-10作為受體親本，配制雜交組合。

1.2 方 法

1.2.1 花藥培養2017年5～7月在重慶市農業科學院生物技術研究所以(481-4-10×939-1)F1和[481-4-10×1021(1)-1]F1為供體親本進行花藥培養。上午9點前摘取處于單核靠邊期的花蕾置于冰盒中帶回實驗室。在超凈工作臺上用70%酒精表面消毒30 s，隨后用0.1% HgCl2消毒7 min，無菌水漂洗4次，之后將花蕾置于裝有無菌濾紙的培養皿中。無菌條件下將花藥接種于胚狀體誘導培養基(MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D+3%蔗糖+7 g/L瓊脂+4 mg/L AgNO3+0.04%活性炭)，9 mm×9 mm培養皿接6個花蕾的花藥，35 ℃高溫預處理5 d[20]。

1.2.2 再生植株倍性鑒定以 939-1 正常二倍體為對照，分別取對照和花培再生植株的新鮮嫩葉1～2 片，標記后送北京紅山風尚科技有限公司進行倍性檢測。倍性檢測的儀器為Partec公司的CyFlow Space，所用試劑為 Partec CyStain UV Precise P 快速倍性分析試劑盒。取0.5 cm2的新鮮葉片，置于培養皿中，加入400 μL 核酸提取緩沖液(Nuclear Extraction Buffer)，用鋒利刀片切碎，放置10 s，再用30μm濾網將樣本過濾至樣品管中，加入 600 μL 染色緩沖液(Staining Buffer)，輕微混勻，即可上機測試。

1.2.3 分子標記輔助選擇鑒定采用Gulyas等[7]開發的CRF-SCAR標記鑒定辣椒花培DH系是否攜帶Rf基因， CRF-SCAR引物序列為F(5′-ATT-TTCAGATTGTGGCGACG-3′)和R(5′-CGACC-ATCACGACGAGG-3′)。利用Quirin等[14]開發的與辣椒抗疫病QTL位點Phyto.5.2.緊密連鎖的FQ01/ RQ01標記鑒定辣椒DH系的疫病抗性。引物為FQ01(5′-CCATAAGGGTTGGTAAATTTA-CAAAG-3′)和RQ01(5′-TCGAGAGATAATTC-AGATAGTATAATC-3′)，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

本研究采用CTAB法提取辣椒葉片DNA。反應體系為20 μL，基因組DNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，滅菌水20 μL。PCR反應程序為94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環；72 ℃ 1 min。

1.2.4 苗期抗性鑒定采用灌根接種法鑒定辣椒花培DH系的疫病抗性，參照NY/T2060.1-2011《辣椒抗病性鑒定技術規程-辣椒抗疫病鑒定技術規程》。在幼苗6葉展平期進行，接種前澆透水，用手術刀在距離幼苗根部3 cm處斷根，用移液器吸取5 mL游離孢子濃度為1×105個/mL孢子懸浮液注入辣椒幼苗根部附近。接種后將植株置于白天溫度25～28 ℃、夜間溫度為20～22 ℃的培養室，每天光照10～12 h，使基質濕度保持近飽和狀態。接種后7 d調查記載各級病株數。病情級別劃分及抗性評價方法參照辣椒抗疫病鑒定技術規程的標準。

1.2.5 DH系農藝性狀調查小區1.333 m×4.0 m，雙行單株種植，每小區種植20株，3次重復。結果盛期進行農藝性狀調查，用卷尺測量株高和冠幅，調查始花節位、果實朝向、單株結果和果形等。隨后摘取辣椒紅熟果實進行室內考種，包括果長、果寬和辣味等。

1.2.6 測交驗證以481-4-1A和0313932A不育系分別作測交親本(母本)，以DH系為測交父本，驗證DH系對不育系的育性恢復能力。盛花期分別取DH系開放的花，分別與481-4-1A和0313932A授粉，授粉后做好標記，共授粉4次，每個DH系測交5株。調查測交后代的育性，育性記載為恢復株率。

2 結果與分析

2.1 DH系的獲得

2017年春季進行辣椒花藥培養，每個雜交組合接種40皿，每皿接種6枚花藥，共接種240枚花藥。結果表明：供體親本(481-4-10×939-1)F1經花藥培養共誘導出22個胚狀體，誘導率為9.17%。其中成苗的有19個，移栽成活后經人工加倍，11個花培再生苗可正常結實，經倍性鑒定均為二倍體(圖1)，即得到了11個花培DH系；[481-4-10×1021(1)-1]F1經花藥培養共誘導出20個胚狀體，誘導率為8.33%，其中成苗14個，移栽成活后經人工加倍，9個花培再生苗可正常結實，即獲得9個DH系。

A.939-1(二倍體)；B.花培再生植株(二倍體)

2.2 分子標記輔助選擇

采用分子標記CRF-SCAR鑒定花培DH系是否攜帶Rf基因，該標記在可育材料中可擴增出870 bp的特異條帶，在不育材料中則無特異條帶。PCR擴增結果表明(圖2，表1)，由供體(481-4-10×939-1)F1獲得的11個DH系中有7個可擴增出870 bp的特異條帶，占63.6%；而來自供體[481-4-10×1021(1)-1]F1的9個DH系中有8個擴增出870 bp的特異條帶，占88.9%。

M. DL2000；1～11. (481-4-10×939-1)F1獲得的DH系；12～20.[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的DH系

采用分子標記FQ01/RQ01驗證花培DH系的疫病抗性，該標記在抗疫病材料可PCR擴增出717 bp大小的特異條帶，感疫病材料則無特異條帶。試驗結果表明(圖3)，供體(481-4-10×939-1)F1獲得的11個DH系中有5個DH系擴增出條帶大小為717 bp的特異條帶，初步認為這5個DH系抗疫病，占45.5%；而供體[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的9個DH系中有4個擴增出717 bp的特異條帶，占44.4%。

M.DL2000；1～11. (481-4-10×939-1)F1獲得的DH系；12～20.[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的DH系

由此可知，通過MAS技術初步篩選到7個含Rf的抗疫病DH系，分別命名為‘渝辣選3-2’、‘渝辣選3-3’、‘渝辣選3-5’、‘渝辣選7-1’、‘渝辣選7-5’、‘渝辣選7-6’和‘渝辣選7-9’，需進一步通過苗期抗性鑒定明確其抗性。

2.3 苗期抗性鑒定

為了進一步明確花培DH系的疫病抗性，采用灌根接種法鑒定MAS技術初選的抗疫病DH系的疫病抗性，以PI201234為抗病對照，以Early calwonder為感病對照，接種辣椒疫霉菌后7 d調查病情(圖4)，根據農業部辣椒抗疫病鑒定行業標準關于依據辣椒疫病病情指數劃分參試品種抗病類型的標準，苗期抗性鑒定試驗結果表明，7個DH系的病情指數介于18.1～36.8之間，其中5個DH系抗疫病，2個中抗疫病(表1)，說明這7個DH系較抗疫病。

A.PI201234；B.Early calwonder；C.渝辣選3-2 Yulaxuan 3-2

表1 辣椒DH系疫病抗性鑒定

2.4 農藝性狀

盛果期調查攜帶Rf基因的7份抗疫病DH系的農藝性狀(表2)，調查結果表明，各DH系的株高介于69.3～88.0 cm，以‘渝辣選7-9’株高最高；冠幅范圍在71.5～78.5 cm之間，以‘渝辣選7-1’的冠幅最大；始花節位在9.0～14.3節之間，以‘渝辣選3-3’的始花節位最高；5個DH系果實均為單生向上，果形為羊角和牛角；果長介于10.3～15.1 cm，以‘渝辣選7-5’果最長；果寬范圍在1.5～2.1 cm之間，以‘渝辣選7-5’果寬最大；單株結果數介于48.9～97.4個，以‘渝辣選3-2’最多，為97.4個；其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’味辣，其余為微辣。綜上所述，其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’果實是單生、長果朝天椒，味辣，可作為親本進行加工型辣椒新品種選育。

表2 辣椒DH系農藝性狀調查

2.5 測交驗證

2019年以481-4-1A和0313932A不育系分別作母本，以DH系‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’分別作父本，測交驗證DH系的育性恢復性。將測交后代定植于國家農作物改良中心(重慶分中心)基地，調查花粉育性(表3)。各測交組合的測交株系均表現可育，各測交株系的恢復株率均為100%。表明‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’均為CMS恢復系，田間調查結果與分子標記輔助選擇結果一致。

表3 測交驗證DH系對CMS不育系的恢復性

3 討 論

據報道，已在150多種植物中發現了CMS，用于簡化F1雜交種子生產中繁重的去雄和人工授粉[21]。但是，目前辣椒上只有極少數品種能應用三系配套進行雜種一代生產[22-23]。主要是由于辣椒育種中CMS恢復系較少，且恢復系的選育較難，因此對于恢復系的選育研究十分重要。然而，通過傳統育種技術選育CMS恢復系費時、費工，而通過花藥培養與常規育種技術、分子標記輔助選擇技術的有效結合，在2～3年內可以培育出聚合多種性狀的DH系。目前，育種家們已經利用花藥培養創制了一些優異的新種質[19,24-27]。

本研究通過常規育種和花藥培養技術將抗疫病恢復系939-1和1021(1)-1的Rf基因和抗病基因導入長果、單生自交系481-4-10，用與Rf基因緊密連鎖的CRF-SCAR標記檢測DH系的育性恢復性，然后采用FQ01/RQ01標記檢測各DH系的疫病抗性。苗期抗性鑒定進一步明確DH系的疫病抗性。最終經PCR檢測與苗期抗性鑒定出5個攜帶Rf的抗疫病DH系。盛花期調查5個DH系的農藝性狀，其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’綜合農藝性狀優良。采用測交法進一步驗證2個DH系對不育系481-4-1A和0313932A的恢復性，兩個不育系各測交組合的DH系測交株系的恢復株率均為100%。由此可見，將常規育種、生物技術和分子標記輔助選擇技術有機結合是創制辣椒新種質的捷徑，顯著縮短了育種材料的純化時間，從而加快育種進程。

利用花藥培養技術快速將幾個性狀或基因進行聚合最關鍵的一個環節是MAS技術，如果已有與目標基因緊密連鎖的分子標記，可通過PCR擴增快速對目標基因進行篩選。該技術已經在水稻上廣泛應用，王興春等[28]利用分子標記輔助選擇與花藥培養相結合快速聚合水稻白葉枯病抗性基因，獲得16株攜有xa5基因。宋丁丁等[25]利用花藥培養和分子標記選擇相結合改良了水稻稻瘟病和褐飛虱抗性。孫海波等[26]利用花藥培養快速培育聚合抗3種水稻病害基因的新種質14個。本研究利用花藥培養與分子標記輔助選擇技術創制了2個長果、單生抗疫病兼CMS恢復的DH系，可用于培育長果朝天椒品種的選育，進而降低生產成本。說明花藥培養技術與分子標記輔助選擇相結合是根據育種目標而創制新種質的有效途徑。

花藥培養與MAS的有效結合，從供體親本配制到分子標記鑒定、抗病性鑒定和測交驗證僅用2～3年(與南繁結合)，高效培育出攜帶Rf基因兼抗疫病的辣椒DH系，即CMS恢復系，比常規育種快，顯著提高了育種效率。隨著現代生物技術的迅猛發展，與各種性狀緊密連鎖的分子標記不斷涌現，花藥培養效率不斷提高，通過該方法實現性狀聚合有望在育種實踐中得到廣泛的應用。