遮陰和施氮對黃檗幼苗葉片光合特性和碳氮計量特征的影響

孫悅燕，郭躍東*

(1 山西農業大學 林學院，山西太谷 030801；2 山西省重點實驗室北方功能油料樹種培育與研發，山西太谷 030801)

全球氣候變化趨勢下，植物光合固碳影響著全球生態系統碳循環，是評價碳循環的重要方法。森林生態系統對氣候變化的物種響應特征在當今生理生態學上倍受關注，尤其是光因子和土壤氮(N)含量對植物生長發育和森林動態演替起主要作用，日益成為研究熱點。天然林地光照資源和土壤氮素空間分布的異質性，客觀上影響著林下幼苗光合能力，對其生長和林分動態產生重要影響，進而限制了植物對光、氮的利用效率，對植物碳代謝起著重要的調節作用。2000～2010年間，大氣中氮化物含量日益增加，中國北部年氮總沉積速率達22.6 kg/hm2[1]，2011年山西北部年氮沉降總量達到47.86 kg/hm2[2]。氮沉降加劇了土壤和葉片中氮含量的增加，對森林更新、土壤動物、微生物、生物多樣性等產生了一定影響[3-5]。森林光照異質性對種子萌發、物種更新及生長[6]影響顯著。有關光氮交互作用對喜光植物生長發育影響的研究表明，在強光條件下，植株光合及呼吸速率、光合潛力達到最大，而光強增加也致使植物光合對氮的需求量呈現增加趨勢[7-9]；遮陰(弱光)能有效降低植物的光合速率[10]，葉片氮素增加也能顯著提高其光合有效速率[7]。同時，植物能通過調節生物量分配，提高單株地上部分的生物量，增加葉片比葉面積和含氮量，有效提高自身光能利用率[11-12]，雖然苗木生長對低氮具有一定的適應性，但持續氮素缺乏也會嚴重抑制苗木生長和存活[13]。森林樹種只有在光強和氮素水平達到一定強度時，才能有效完成其更新過程。森林樹種生態化學計量特征可反映林木體內養分吸收利用狀況。外源氮輸入直接影響植物養分元素C、N含量及C/N[14]，增強林木光合能力，提高凈光合速率及氮素光合利用率[15-16]。

黃檗 (Phellodendronamurense)屬于蕓香科(Rutaceae)黃檗屬(Phellodendron)，國家二級保護植物[17]，為中國東北闊葉紅松林頂極植被的“三大硬闊”樹種之一，主要分布在東北地區小興安嶺和長白山林區(海拔300～1 200 m)，在華北燕山山脈、北京、內蒙古、山西有少量分布[18-19]。黃檗喜光肥[20]，林下不能正常生長[21]。在群落演替過程中，若無林隙或人工干預，黃檗幼苗由于林下光照不足，難以正常生長[17,20,22-23]。但也有研究發現黃檗具有一定的耐陰性，在全光照和郁閉度較高的林下也能完成有效更新[24-26]。可見，有關黃檗的耐陰性存在爭議，關于光氮交互作用對林木光合、形態及生態化學計量元素影響鮮有報道。為深入了解黃檗的生態習性，尤其是其幼苗的耐陰性，本研究以黃檗3年生幼苗為對象，分析光氮復合作用對其光合特性和葉片形態的影響，旨在揭示黃檗幼苗對光照異質性和氮素的需求及其光合生理和生態化學計量特征對光氮復合作用的響應，以期為今后黃檗引種栽培及針闊混交林建設提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試2年生黃檗幼苗由山西省襄汾縣國營苗木有限公司(35°38′ N， 116°02′ E)引栽于山西農業大學林業站(37°25′N、112°34′E)，經一年緩苗，長勢良好。種植地為壤土，其表層土壤全氮含量為2.48 mg·g-1，有機質含量為1.86 mg·g-1，田間持水量為27.64%。2018 年3月進行3年生黃檗幼苗田間移栽，株行距2.5 m×3.0 m，確保彼此互不影響，供足水分，及時除草，挑選均勻一致(苗高、地徑及頂芽)的苗木，于5月下旬進行遮光和氮添加處理。

1.2 試驗設計

采用光氮雙因素隨機區組設計，分別設置3個光照水平和3個氮添加水平，共組成9個處理組合，每個處理組合設4個區組(重復)，每重復1株，共選取36株幼苗。整個試驗期間保證苗木水肥充足，無雜草生長，8月底對試驗處理材料進行氣體交換參數和相對葉綠素含量的測定。

其中，3個光照水平分別為：(1)對照(S0)，全光照100%，光照度為1 854.2 μmol·m-2·s-1；(2)輕度遮光(S1)[27]，設置1層遮陽網透光率為對照(S0)的21.4%，光照度為396.8 μmol·m-2·s-1；(3)重度遮光(S2)，設置2層遮陽網透光率為對照(S0)的8.7%，光照度為162.2 μmol·m-2·s-1。S2光強水平參考林隙自然環境下的光環境(9%～5%)設置[28-29]。

氮肥采用含氮質量分數為46%的尿素，距離植株0.15～0.3 m直徑范圍內，環狀施肥，均勻撒開，覆蓋1層1～2 cm厚土壤后用噴壺均勻噴灑3 000 mL自來水，使氮肥融化滲入土壤。3種施氮水平分別為：1)對照(F0)，不施氮肥；2)輕度氮添加(F1)，添加尿素總量13 g(28.21 g·m-2)；2)重度氮添加(F2)，添加尿素總量26 g(純氮56.42 g·m-2)[16]。氮肥于6月和7月上旬分2次施加，第一次施撒尿素分別為5 g(F1，純氮10.85 g·m-2)和10 g(F2，純氮21.70 g·m-2)，第二次分別為8 g(F1，純氮17.36 g·m-2)和16 g(F2，純氮34.72 g·m-2)，分別占各施氮水平總量的38.46%、61.54%。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 相對葉綠素含量用便攜式葉綠素含量測定儀(SPAD-502，Japan)測定黃檗幼苗葉片相對葉綠素含量(SPAD值)，選擇試驗處理幼苗第3側枝上的第3-4對，當年生、健康無病蟲害葉片，每片葉子按主脈分左、右和葉尖測量3次，取平均值作為該葉片相對葉綠素含量值。

1.3.2 氣體交換參數葉片選取方法同1.3.1，于9:00-14:00之間，使用Li-6400光合儀(Li-COR Inc.,Nebraska,U.S.A)配備的標準葉室與Li-6400-02B紅藍光源，在光合有效輻射為1 200 μmol·m-2·s-1，葉溫30 ℃，相對濕度60%時進行凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、大氣二氧化碳濃度(Ca)等氣體交換參數的測定，然后按照公式計算氣孔限制值(Ls)和瞬時水分利用效率(WUE)。

Ls=1-Ci/Ca

WUE=Pn/Tr

1.3.3 化學計量元素C、N含量選取葉片方法同1.3.1，105 ℃殺青120 min，65 ℃烘干48 h至恒重，研缽手工研磨，去除主次葉脈后過篩(200目)，用百萬分之一天平稱取樣品2～3 mg，放入錫舟，并用鑷子將錫舟包好，清除錫舟外樣品，保證樣品質量。采用色譜技術(PE2400 Series II CHNS/O 元素分析儀)，CHN 模式測定葉片全碳和全氮元素含量，并計算C∶N及瞬時光合氮利用效率(PNUE)，PNUE=Pn/N。

1.4 光氮互作處理綜合效應評價

采用模糊數學中的隸屬函數(Membership)法[7]，對采集的黃檗幼苗生理及化學計量元素指標進行光氮處理效應綜合評價：

Ui=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

如果為負相關, 則用反隸屬函數進行轉換, 計算公式為:

Ui= 1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

上述公式中，Ui是第i個指標的隸屬函數值；Xi是指第i個測定指標；Xmax指該指標的最大值；Xmin指該指標的最小值。Ui值介于0～1之間，越大表明幼苗對遮光適應力及其對氮添加的耐性越強。按照隸屬函數均值大小劃分各處理黃檗幼苗抗逆性，1≥Ui>0.6為高效型，0.6≥Ui>0.5為中效型，Ui≤0.5為低效型[7]。

1.5 數據處理

采用R語言(R x64 3.5.1)軟件(Robert Gentleman and Ross Ihaka,the Statistics Department of the University, Auckland)，以ps.aov包進行雙因素方差分析，并利用agricolae包LSD法進行多重比較(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 遮光和氮添加對黃檗幼苗葉片氣體交換參數和葉綠素含量的影響

表1顯示，黃檗幼苗葉片的氣體交換參數凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、水分利用率(WUE)、水分限制值(Ls)、氣孔導度(Gs)以及相對葉綠素含量(SPAD值)均受到遮光、氮添加顯著影響(P<0.05)，除Pn外還受到光氮交互作用的極顯著影響(P<0.01)；同時，各指標光、氮單因素方差分析的F值表現為光照因素大于氮添加因素，說明光照是影響黃檗幼苗相對葉綠素含量和氣體交換參數的主要因素。

表1 光氮交互下黃檗幼苗葉片光合氣體交換參數和化學計量特征的方差分析(F值)

2.1.1 遮光效應表2顯示，與全光環境S0相比，輕度遮光(S1)處理黃檗幼苗葉片的SPAD值、Tr和Gs均顯著增加(P<0.05)，分別達到S0的1.20、1.20和1.32倍，而其Pn則稍有降低，其WUE和Ls則均顯著降低；重度遮光(S2)處理的SPAD值仍顯著高于S0，卻較S1顯著降低，其Gs與S0無顯著差異，而其Pn、Tr、WUE和Ls則均比S0顯著降低；尤其是S2處理的Pn僅為S0的63.05%，也比S1處理顯著降低33.22%(P<0.05)。遮陰能誘導黃檗幼苗通過增加葉綠素合成來適應弱光環境，但卻明顯抑制了葉片的凈光合速率和水分利用效率。

2.1.2 氮添加效應表2同時顯示，與不施肥對照F0相比，輕度氮添加(F1)黃檗幼苗葉片的SPAD值和Tr分別顯著降低10.50%和15.06%，而其余指標則均無顯著變化；重度氮添加(F2)黃檗幼苗的SPAD值、Pn、WUE、Tr和Gs分別比F0顯著降低6.02%、12.76%、8.97%、13.67%和17.20%，僅其Ls與F0無顯著差異；與F1處理相比，F2處理黃檗幼苗的SPAD值顯著增加，而其Pn、WUE和Ls則分別顯著降低20.38%、13.39%和8.35%，其余指標無顯著變化。黃檗幼苗葉片光合氣體交換參數和葉綠素含量隨著氮添加水平增加而下降，且重度氮添加的抑制效應大多達到顯著水平。

表2 遮光和氮添加下黃檗幼苗相對葉綠素含量和氣體交換參數的變化

2.1.3 光氮交互效應由表3可知，黃檗幼苗葉片的Pn在各光氮組合處理間均無顯著差異。黃檗幼苗葉片的其他參數在各光氮組合處理間均存在顯著性差異。其中，SPAD值與其他氣體交換參數表現不同，以S1F0、S2F0和S1F2處理組合顯著較高，而以全光照(S0)處理組合顯著最低。氣體交換參數Tr和Gs以光照S1處理組合明顯較高，而以S2F1、S0F2、S2F2明顯較低；WUE和Ls均以S0F2顯著最高，以S0F0、S0F1次之，而以S2F2和S2F0處理組合顯著最低。

表3 光氮交互下黃檗幼苗相對葉綠素含量和氣體交換參數的變化

2.2 光氮交互對黃檗幼苗葉片化學計量特征的影響

黃檗幼苗葉片N含量、C含量、C∶N及瞬時光合氮利用效率(PNUE)的方差分析結果(表1)顯示，遮光、氮添加及其交互作用均對黃檗幼苗葉片的全N含量、全C含量、C∶N及PNUE產生了顯著(P<0.05)影響，且單因素對黃檗幼苗碳氮化學計量特征的遮光F值(F光)遠大于氮添加F值(F氮)，說明光照是影響黃檗幼苗葉片化學計量特征的主要因素。

2.2.1 遮光效應由表4可知，隨遮光水平增加，黃檗幼苗葉片的N和C含量均呈現出先降低后升高的趨勢，而其C∶N和PNUE則呈現先增加后陡降的趨勢，且它們在光照處理間均存在顯著差異。其中，S1處理葉片N和C含量分別比S0顯著降低18.32%和4.41%，同時也分別比相應的S2處理顯著降低25.28%和3.03%；S2處理葉片的N含量比S0顯著升高9.32%，其C含量則比S0顯著降低1.41%；黃檗S1處理幼苗葉片的C∶N和PNUE分別比S0對照顯著升高16.50%和16.54%，而S2處理的C∶N和PNUE分別比S0顯著降低10.27%和27.65%，也分別比S1處理顯著降低22.98%和37.92%。可見，隨遮光程度從輕到重，光資源受到限制，黃檗幼苗通過調節體內養分利用率來應對不利光環境。

2.2.2 氮添加效應隨著氮添加水平的增大，黃檗幼苗葉片的N和C含量均先增加后降低，C∶N逐漸增加，PNUE逐漸降低(表4)。其中，F1處理黃檗幼苗葉片N和C含量分別比F0對照顯著提高4.17%和5.51%，同時也顯著高于相應的F2處理，而F2處理的N含量比F0顯著降低3.53%，其C含量與F0相近；F2處理黃檗幼苗葉片的C∶N分別是F1處理和F0對照的1.06和1.03倍，其葉片的PNUE則分別是F1處理和F0對照的74.82%和82.68%。可見，輕度氮添加使黃檗幼苗葉片的N和C含量顯著增加，重度氮氮添加使黃檗幼苗葉片的C∶N顯著增加，PNUE顯著降低。

表4 遮光和氮添加下黃檗幼苗葉片化學計量特征的變化

2.2.3 光氮交互效應表5顯示，黃檗幼苗葉片N含量在光氮組合處理S2F1、S2F2顯著較高，而在組合處理S1F0、S1F1、S1F2顯著較低，最高的S2F1、S2F2處理分別比最低的S1F2處理顯著提高了49.29%和43.41%；黃檗幼苗葉片C含量在光氮組合處理S0F1、S2F1顯著較高，而在S1F2處理最低并與其余組合處理差異顯著，S0F1、S2F1處理分別比S1F2處理顯著增加12.46%、10.79%；黃檗幼苗葉片C∶N以光氮組合處理S1F2、S1F0、S1F1顯著較高，而以組合處理S2F0、S2F1、S2F2顯著降低，最高的S1F2處理比最低的S2F2處理顯著提高了37.51%；黃檗幼苗葉片PNUE在光氮組合處理S1F1、S1F0顯著較高，而以組合處理S2F1、S2F2顯著較低，并與其余處理差異顯著，最高的S1F1、S1F0處理分別是最低S2F2處理的2.75和2.68倍。可見，黃檗幼苗葉片N和C含量在重度遮光/輕度氮添加時(S2F1)具有較大值，而其葉片C∶N和片PNUE在輕度遮光/無氮添加(S1F0)時具有較大值。

表5 光氮交互下黃檗幼苗葉片化學計量特征的變化

2.3 光氮交互對黃檗幼苗生理及化學計量特征影響效應的綜合評價

采用隸屬函數法綜合評價各光氮復合作用對黃檗幼苗葉片生理特性及化學計量特征影響。由表6可知，光氮處理組合S1F0、S0F1和S1F1隸屬函數平均值較高，介于0.631～0.652之間，為高效型；光氮處理組合 S0F2、S0F0和S1F2隸屬函數平均值次之，介于0.533～0.559之間，屬于中效型；而光氮處理組合S2F0、S2F1和S2F2，隸屬函數平均值介于0.239～0.466之間，屬于低效型。黃檗幼苗葉片生理特性及化學計量元素對光氮復合處理的隸屬函數綜合評價總均值為0.518，屬于中效型。綜上，全光照(S0)和輕度遮光(S1)條件下3種氮素水平均較適宜黃檗幼苗生理生長，其中以輕度遮光時S1F0和S1F1及全光照時S0F1為最佳組合。重度遮光條件下3種氮素水平處理黃檗幼苗葉片生理特性及化學計量特征表現均最差，不適宜黃檗幼苗生長。

表6 光氮交互對黃檗幼苗生理及化學計量特征的綜合效應評價

3 討 論

3.1 黃檗幼苗光照需求及其可塑性

光照強弱是影響植物生理特性的主導因素，在森林更新過程中光照強度對林木幼苗的生長發育乃至成活影響更甚。本研究表明黃檗幼苗受到輕度遮光(透光率為21.4%)時能夠通過提高葉片葉綠素相對含量(SPAD)，降低水分利用效率(WUE)和氣孔限制值(Ls)，增強幼苗光合能力來適應弱光環境，表明3年生黃檗幼苗對遮光有一定的調節能力。另有研究發現林下黃檗幼苗能忍耐一定程度的遮陰，且能完成正常更新[24-26]，可見適度遮陰能有效改善植物體光合特性[7]。有關研究表明遮陰顯著降低黃檗葉片的光合速率[21]；弱光下黃檗幼苗通過增加葉片葉綠素含量，能有效利用弱光，積累有機物質，且其光能利用率高于全光環境[27,30-31]，能適應更寬的光強范圍[32]，提高在多變光環境條件下的適應性。本研究結果與前人相關報道一致。

3.2 氮添加對黃檗幼苗生理特性的影響

植物體氮含量是影響植物生長的重要因子之一。本研究發現在適度施氮水平下，黃檗幼苗通過調節氣孔導度和蒸騰速率，增加水分利用率及氣孔限制值，以適應氮添加，提高凈光合速率。但過量施氮則抑制黃檗幼苗葉片氣孔的開張，降低氣孔導度、蒸騰速率和水分輸送效率，抑制其光合作用，導致凈光合速率下降，光合能力降低，影響其正常生長。相關研究表明氮添加整體上可促進植物的光合作用，且隨施氮水平增加，植物光合速率先增加后降低，即隨施氮量增加，葉片氮含量增加，凈光合速率顯著增加，當氮添加程度超過一定閾值，植物體水分被用于調節水分利用率，抑制氮代謝水平，光合效率受到限制，這是其適應氮添加的生態策略[33-35]。關于黃檗、長白落葉松(Larixolgensis)、考來木(Correacarmen)及羊草(Leymuschinensis)的相關研究也得出相似結論[35-37]。

3.3 光氮互作條件下黃檗幼苗的生理生態適應機制

光照條件和氮肥對植物的生長至關重要，其中任一因素的變化都可直接影響葉片養分特征。輕度遮光時黃檗幼苗通過提高氮養分利用效率，降低葉片氮含量，使PNUE和C∶N顯著升高。同時在光資源輕度受限時也可通過提高氮吸收利用效率有效補償碳損失，致使光合作用較全光照下略有降低，但二者并無顯著差異。因此遮陰條件下適量氮供應最有利于其生理生長[25]。本研究中重度遮光時，黃檗幼苗葉片C、N含量同時增加，但其PNUE和C∶N顯著降低，表明光資源嚴重不足時，幼苗的養分利用補償機制受損，使得凈光合速率顯著降低。有關木荷(Schimasuperba)、玉米(Zeamays)、烤煙和高山杜鵑(Rhododendronlapponicum)相關研究也得出類似的結論[38-40]。

本研究中，光、氮單因素對黃檗幼苗生理及碳氮化學計量特征的分析顯示，光照是比氮素更重要的影響黃檗幼苗生理特性的因素。隸屬函數綜合評價表明，輕度遮光、無氮添加(S1F0)和輕度氮添加(S1F1)及全光照、輕度氮添加(S0F1)為適宜黃檗幼苗生長的最佳光氮組合，且S0F1處理的黃檗幼苗葉片C含量和凈光合速率均最大。光氮互作對閩楠(Phoebebournei)幼苗光合生理特性的影響研究得到類似結論[7]。在全光照條件下，黃檗幼苗碳代謝及光合速率較快，受輕度氮添加時葉片氣孔打開，降低蒸騰速率，保證胞間CO2濃度，降低水分利用速率，導致葉片N含量降低，光合速率增加，利于碳累積；輕度氮添加下隨著氮添加水平提高，幼苗氣孔導度開始降低，蒸騰速率繼續下降，水分利用效率和氣孔限制值增加，葉片N、C含量降低，葉片氮除主要用于自身氮代謝功能消耗外[25]，分配給光合作用的氮較少，導致PNUE和C∶N增加，光合速率降低。光照充足時，黃檗幼苗光合生理作用旺盛，在適量氮添加時有利于體內養分累積及光能利用，但當氮過量時(重度氮添加)反而不利于其幼苗的碳積累[41]。

黃檗幼苗葉片SPAD值輕度遮光下升高，在同時受到輕度氮添加時較對照(F0)降低，但在同時受到重度氮添加下反而高于對照，這與SPAD值與葉片氮含量之間的正相關結果[42]不一致。國外對3種觀賞木本植物的研究表明，莢蒾屬(Viburnum)樹種在SPAD值與葉片氮含量相關性上區別于其他樹種，可能是單位面積干葉重(LMA)變異較大，葉片單位重量氮含量、單位面積氮含量與SPAD之間相關性受LMA轉換因子影響導致相關性有別于其他物種[43]。LMA功能性狀指標的變異在楊樹葉片發育表型可塑性中扮演重要作用[44-45]。未來將通過對LMA、比葉面積等相關光合生理指標進行進一步研究，揭示黃檗幼苗葉片表型可塑性與光氮互作的機理。

綜述所述，黃檗幼苗葉片生理特性及化學計量特征對光氮交互處理響應，經隸屬函數綜合評價屬于中效型，輕度遮光時無氮添加(S1F0)和輕度氮添加(S1F1)及全光照時輕度氮添加(S0F1)為適于幼苗生長的最佳光氮組合，且S0F1處理黃檗幼苗葉片的C含量及凈光合速率均最大，光環境是影響黃檗幼苗光合作用的主導因子。黃檗屬于喜光樹種[46]，在不受光照限制的情況下，增施適量氮肥在一定程度上可以增加葉片相對葉綠素含量，利于生長；但光資源受限和過量增施氮肥卻抑制葉綠素的合成及氮素的輸送，光合作用效率降低，不利于黃檗幼苗對水分及養分資源的利用，影響其地上部分的正常生長，總體長勢較弱。因此，當光照不足時，應該增施適量氮肥使植物體在保證生理代謝能力不變的前提下，減小蒸騰失水，保證水分吸收，以提高光合速率。