‘錦苗標靶’誘抗劑抑制列當寄生向日葵的機制研究

段 銳，劉志達，郭曉晴，張之為，張文兵，趙 君，張 鍵*

(1 內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院，呼和浩特 010018；2 內蒙古自治區農牧業技術推廣中心經濟作物技術處， 呼和浩特 010020)

向日葵(HeliauthusannuusL.) 又名朝陽花，一年生菊科向日葵屬植物，原產于北美，目前在世界各地均有種植，并逐漸發展成為具有較高經濟價值的作物之一。中國向日葵種植面積約為80萬hm2，其中內蒙古和新疆是中國向日葵的主要種植地區[1]。近年來，由于向日葵雜交種的大量進口，國內檢疫力量的薄弱，導致列當在中國向日葵主產區呈現出大面積擴增和蔓延的態勢。據調查，普通發病地塊能夠導致向日葵減產15%～30%，嚴重的地塊可減產60%[2]。目前，向日葵列當已經成為限制中國向日葵產業發展的主要瓶頸因素，極大地影響了中國向日葵產業的穩步發展。

向日葵列當(OrobanchecumanaWallr.)又稱毒根草、兔子拐棍，是雙子葉植物綱管狀花目列當科列當屬一年生寄生草本植物。由于自身缺乏葉綠素，不能進行光合作用，無真正的根，只是靠短須狀假根侵入向日葵的根系組織內奪取水分、碳水化合物和礦質營養來滿足自己的生長和繁殖[3]。向日葵列當的寄主廣泛，主要寄生于向日葵、西瓜、番茄等作物[4]。目前，向日葵列當在中國主要發生在河北、新疆、內蒙古等地區，其中新疆和內蒙古向日葵種植區列當的發生面積最大，危害最為嚴重[5]。

植物免疫誘導抗病性是利用誘導因子激活植物自身的天然免疫系統，增強植物對病原物侵害和逆境脅迫的防御能力[6]。利用弱毒的病原菌侵染植物后，植物的防御反應被激活，被侵染部位釋放出信號產物，如水楊酸(SA)被轉移到植物其他部位進而誘發植物全株性防御反應體系的建立，即系統獲得性抗性(SAR)的建立。植物誘導的系統性抗性，通過調節植物自身的防衛、代謝系統，誘導產生免疫反應，以達到延遲或減輕病害發生的目的[7]。因此，植物的這種誘導抗病性逐漸得到了廣泛的關注。

植物誘抗劑分為生物源和非生物源兩類，生物源類誘抗劑包括寡糖類誘抗劑(如幾丁寡糖)、蛋白質和類糖源誘抗劑(如糖蛋白)、微生物類誘抗劑(如真菌)；非生物源類誘抗劑包括物理誘抗劑(如電磁處理)和化學誘抗劑(如抗生素)[8]。

在植物抵御病原菌入侵過程中，寄主細胞壁中的胼胝質會迅速沉積堵塞篩管，調控篩管的運輸功能，從而影響植物正常的生長代謝過程。病原物還會誘導活性氧(ROS)的積累，進而會促使體內ROS清除酶活性迅速增高，促使ROS轉換為毒害較低或無害的物質。此外，一些信號分子如SA、JA以及ETH等也會在誘抗劑的作用下大量積累，促使寄主系統獲得性抗性的建立。

目前，植物免疫誘抗劑被廣泛應用于農作物有害生物的防控中[9]，特別是在向日葵上也有一定的應用。如 Sauerborn J等[10]利用苯并噻二唑誘導向日葵抑制列當的寄生取得了良好的效果。Yang等[11]的研究表明，外源施用水楊酸能誘導向日葵產生防御機制抵抗向日葵列當的侵染。Li等[12]利用5-氨基乙酰丙酸(ALA)抑制列當侵染向日葵，施用ALA后能夠促使JA和ETH生物合成途徑的相關基因在列當侵染后顯著上調。這些研究表明，外源施用誘抗劑能夠抑制列當對向日葵的寄生，而這種抑制效果是通過在結構抗性以及生理生化水平抗性的變化而實現。

‘錦苗標靶’是一種富含氨基酸的水溶肥誘抗劑，可通過葉片噴霧或根系澆灌來誘導植物抗性的建立。本研究通過根系澆灌‘錦苗標靶’，研究了在不同向日葵品種上列當寄生后向日葵的結構抗性以及生理生化抗性指標的變化。這一研究結果將為利用‘錦苗標靶’防控向日葵列當提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試的2個向日葵為食葵品種LD5009(購自北京凱福瑞種業公司)和JK103(購自華夏種業公司)。

供試藥劑‘錦苗標靶’購自內蒙古錦苗農業發展有限公司，濃度為1.08 g·mL-1，基于實驗室前期研究結果，室內根系澆灌的稀釋倍數為1∶2 000。

向日葵列當的種子采自于內蒙古四子王旗小前地村(E111°42′，N41°31′)，生理小種鑒定為G小種。

1.2 向日葵幼苗準備(培養皿濾紙法)

(1)催芽：將向日葵種子置于培養皿內，自來水浸泡24 h后用紗布包好，覆蓋濕抹布后，在室溫下催芽4～5 d，其間每日需用自來水沖洗1～2次。

(2)備皿：首先，在13 cm×13 cm的方皿內鋪厚度約為4 cm的棉花并將其浸濕；其次，剪與方皿等大的濾紙，并稱取4 mg已純化的列當種子于濾紙上，用刷子使其均勻分布于濾紙四分之三的位置并鋪于已浸濕的棉花上備用。

(3)接苗：將已催好芽的向日葵幼苗去殼后將其根平鋪于方皿內，同時，將子葉置于皿外側，每皿接種2株向日葵幼苗。之后用錫箔紙包裹方皿，使其垂直放置在光照培養箱內進行培養，每2 d澆水1次。培養條件：溫度23～27 ℃、相對空氣濕度約50%～70%、光周期 14 h/10 h(光照/黑暗)。

1.3 試驗方法

1.3.1 根系澆灌與取樣(1)根系澆灌：將‘錦苗標靶’與蒸餾水按照1∶2 000稀釋到三角瓶中，避光保存。接苗10 d后在解剖顯微鏡下觀察列當種子萌發的情況；在向日葵幼苗長到13 d時，此時列當種子萌發的芽管剛剛接觸到向日葵根系但是還未有瘤結形成時，向培養皿中向日葵的根系均勻澆灌5 mL稀釋的‘錦苗標靶’藥劑，對照澆灌5 mL的蒸餾水。

(2)取樣：在根系澆灌處理液后0、24、48 和72 h進行取樣。每日在相同時間取帶有瘤結的向日葵根系，作為后續試驗的材料。每個處理設3次重復。

1.3.2 向日葵生長指標的測定先將泥土、蛭石和基質以1∶1∶1的比例混合均勻，一部分先加水拌勻后，鋪在12 cm(直徑)×13 cm(高)的營養缽三分之一處，另一部分混合土加0.1 g列當并充分混勻倒入營養缽中間三分之一，上層鋪少許濕潤的混合土。將提前準備好的LD5009和JK103的種子按照每個營養缽2粒種到土里，在種子表面覆蓋1層混合土。將營養缽置于光照培養箱內，培養條件與向日葵幼苗培養條件相同。每個處理設8次重復。在播種后第13天根系澆灌1∶2 000‘錦苗標靶’稀釋液，待向日葵生長20 d后，統計各處理向日葵根系列當的寄生數量和鮮干質量，以及向日葵株高、莖粗、地上和地下部鮮干質量。

1.3.3 胼胝質的組織化學染色取新鮮的向日葵根系，利用苯胺藍進行染色[13]。稱取0.01 g苯胺藍溶于150 mmol/L的K2HPO4中(pH 9.5)，將向日葵根系浸泡于染液中染色1 h，在顯微鏡下觀察染色情況。每個處理重復3次。

1.3.4 H2O2含量測定利用上面不同的根系樣本，按照索萊寶公司提供的檢測試劑盒測定H2O2含量。在波長415 nm測定樣本吸光度(A)，利用公式計算H2O2含量。每個樣品3次重復。

H2O2含量(μmol/g)=2×ΔA測定÷ΔA標準÷W

式中：ΔA測定=A測定管-A空白管；ΔA標準=A標準管-A空白管；W為組織質量，單位為g。

1.3.5 ROS清除酶活性測定利用上面不同的根系樣本進行ROS清除酶活性的測定。其中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光還原法[14]；過氧化物酶(POD)測定采用愈創木酚法[15]；過氧化氫酶(CAT)測定采用H2O2消光系數法[16]；多酚氧化酶(PPO)測定采用分光光度法[17]。每個處理設3次重復。

1.3.6 抗性相關基因表達分析不同樣本總RNA的提取按照Li等[12]的方法。使用金百特試劑盒反轉錄成cDNA。qRT-PCR特異性引物見表1。qRT-PCR采用CFX96TM系統(Bio-Rad)，反應體系根據TaKaRa操作說明，反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，59 ℃退火和延伸45 s，40個循環。

1.4 數據處理

采用SPSS方法對各指標的差異顯著性進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 ‘錦苗標靶’對向日葵列當寄生的抑制

向日葵根系澆灌誘抗劑‘錦苗標靶’后，對不同品種列當寄生的影響結果如表2所示。在施用‘錦苗標靶’20 d后，LD5009中列當瘤結數相比對照(施用清水，下同)減少了95.5個，寄生率降低了98.20%；列當的鮮質量和干質量分別降低了0.35和0.08 g，降幅為94.60%和81.63%；而相應的向日葵株高和莖粗分別增加了2.09 cm和0.52 mm，增幅為14.92%和15.29%；地上部的新鮮質量和干質量也分別增加0.17和0.08 g，增幅為4.42%和25%。JK103中列當瘤結數相比對照減少37.5個，寄生率降低了98.04%；列當的鮮質量和干質量也分別降低了0.33和0.04 g，降幅為97.06%和82.69%；而向日葵的株高和莖粗分別增加2.07 cm和0.39 mm，增幅為12.26%和9.70%；同時，JK103地上部的新鮮質量和干質量分別增加0.30和0.12 g，增幅分別為6.79%和27.27%。

表2 誘抗劑抑制列當對向日葵的寄生

2.2 ‘錦苗標靶’對向日葵根系胼胝質沉積的影響

施用‘錦苗標靶’后，向日葵根系細胞壁胼胝質染色結果(圖1，A-D)顯示，LD5009錦苗標靶在瘤結(圖中標紅色五角星)附近0 h(圖1，A)胼胝質的沉積量顯著低于JK103錦苗標靶。在根系澆灌24 h(圖1，B)后，無論是處理還是對照，不同品種向日葵根系的瘤結附近，細胞壁中胼胝質的沉積量相比0 h均有增加。但是，就整體而言，JK03錦苗標靶根系中沉積的胼胝質量更多。在根系澆灌48 h(圖1，C)后，處理組與對照組根系中瘤結附近的胼胝質均有大量的沉積，整體沉積量均高于24 h根系樣本中的沉積量。在根系澆灌72 h(圖1，D)后，根系中瘤結附近胼胝質的沉積量較48 h略有下降。

施用‘錦苗標靶’后，向日葵根系細胞壁胼胝質染色后的熒光結果(圖1，E)顯示，在根系澆灌0 h，JK103、LD5009胼胝質的熒光強度沒有明顯差異；24 h后，JK103錦苗標靶、LD5009錦苗標靶胼胝質熒光強度均有所增加，且與各自對照差異顯著。48 h后，JK103錦苗標靶、LD5009錦苗標靶根系胼胝質熒光強度與其對照差異顯著，且熒光強度均達到最大值。72 h后，2個品種的處理與對照在胼胝質熒光強度上均無顯著差異。

A-D為LD5009和JK103分別在0、24、48和72 h取樣染色，紅色五角星代表瘤結

2.3 ‘錦苗標靶’對向日葵根系中H2O2積累的影響

根系澆灌‘錦苗標靶’后，不同品種向日葵根系中H2O2含量的測定結果(圖2)顯示，誘抗劑處理24 h后，JK103錦苗標靶H2O2含量較JK103CK增加了0.31 μmol·g-1，增幅為9.63%；LD5009錦苗標靶較LD5009CK增加了1.81 μmol·g-1，增幅為208.05%。48 h后，JK103錦苗標靶、JK103CK和LD5009錦苗標靶中H2O2含量均比24 h的樣本有所下降，僅LD5009CK較24 h增加了1.28 μmol·g-1，增幅為147.13%。72 h后，所有處理樣本中H2O2含量均有所降低，其中LD5009錦苗標靶較對照降低了38.24%，而JK103錦苗標靶較對照降低了34.23%。

2.4 ‘錦苗標靶’對向日葵根系中ROS清除酶活性的影響

根系澆灌‘錦苗標靶’后，JK103和LD5009根系的4種ROS清除酶活性總體均呈現先升高后下降的趨勢(圖3)。JK103錦苗標靶和LD5009錦苗標靶均在48 h達到峰值，此時，JK103錦苗標靶較JK103CK的SOD、POD、CAT、PPO活性分別增加了69.77 U·g-1、5.44 U·g-1·min-1、1.88 U·g-1·min-1和527 U·g-1·min-1；LD5009錦苗標靶較LD5009CK的4種ROS清除酶的活性分別增加了25.91 U·g-1、13.16 U·g-1·min-1、0.50 U·g-1·min-1和313 U·g-1·min-1。

圖3 ‘錦苗標靶’處理后向日葵根系抗氧化酶活性的變化

2.5 ‘錦苗標靶’對抗性相關基因轉錄水平的影響

為了明確‘錦苗標靶’對向日葵抗性基因轉錄水平的調控影響，在誘抗劑處理下對7個不同抗性基因的轉錄本進行了檢測。結果(圖4)顯示，在根系澆灌‘錦苗標靶’后，供試7個抗性基因的相對表達量均呈現先升高后下降的趨勢，尤其以48 h表達量最為顯著。

圖4 ‘錦苗標靶’處理后向日葵根系抗性相關基因的表達

在‘錦苗標靶’處理24 h后，LD5009錦苗標靶中的CAT、PAL、Mn-SOD和XTH6基因的相對表達量相比對照分別上調了347.02%、63.61%、115.25%和60.26%；而ACCO1和PR1基因表達量卻分別下調了24.81%和48.18%；LOX基因表達量沒有顯著的變化。JK103錦苗標靶樣本中CAT、LOX、PAL、XTH6相對表達水平相比對照也分別上調了43.10%、51.91%、104.54%和42.36%，其余基因與對照無顯著差異。

在‘錦苗標靶’處理48 h后，JK103和LD5009中7個抗性基因的相對表達量比對照均表現出顯著上調的趨勢，LD5009錦苗標靶比LD5009CK的7個抗性基因分別上調了1 386.48%、1 194.69%、1 291.96%、3 279.22%、7 495.45%、6 295.50%和5 007.25%；JK103錦苗標靶相對于JK103CK呈現上調趨勢，總體上調幅度低于LD5009錦苗標靶。

在錦苗標靶處理72 h后，除了LOX基因在LD5009錦苗標靶中的相對表達量呈現上調趨勢外，其他供試的抗性基因在LD5009錦苗標靶中均下調。在JK103錦苗標靶中，除了CAT和ACCO1基因呈現下降趨勢外，其余基因的表達量與對照相比幾乎沒有發生變化。

3 討 論

向日葵列當是中國向日葵產區的主要草害之一，目前國內采用的主要防治方法尚不能有效抑制列當種子的萌發和寄生，挖掘、篩選抗列當的向日葵種質資源是培育抗性品種的基礎[18]，同時明確向日葵和列當的互作機理，加快尋找防控向日葵列當的新措施成為當務之急。誘抗劑通過激發植物本身的防御系統來抵抗病原物的襲擊，已在其他植物的互作過程中效果顯著，因此，誘抗劑具有較傳統的防控向日葵列當措施更大的潛力和挖掘空間。

本試驗通過‘錦苗標靶’誘抗劑來誘導向日葵產生抗性抵御列當侵染，以減輕向日葵列當的危害。結果表明：‘錦苗標靶’對向日葵列當的寄生有顯著的抑制效果，在向日葵列當寄生前(瘤結未形成)施用，僅有一小部分列當可以正常寄生在向日葵根系并形成瘤結，然而絕大部分列當因無法建立寄生關系而死亡。誘抗劑處理抑制了列當對向日葵根系的寄生，從而減少了列當在向日葵根系上的寄生數量。本結果與柳慧卿等[19]研究結果一致。

本試驗中列當生物量測定結果顯示，施用‘錦苗標靶’的效果在JK103的各項生長指標均最為顯著，LD5009在施用外源添加劑的情況下能達到與JK103相同的抑制效果，這與王建蘇[20]的研究結果相似，預示著種植感列當但是商品性好的向日葵品種結合施用誘抗劑，可以整合在向日葵列當綜合防控技術體系中。

‘錦苗標靶’處理后24 h后，2個向日葵品種中的ROS迅速達到峰值，為避免向日葵細胞受ROS毒害作用，ROS清除酶的活性也隨之被誘導升高，就4種ROS清除酶活性而言，JK103被誘導的程度高于LD5009。在列當侵染的過程中，這些ROS清除酶都扮演著重要的角色。這與張默靖等[21]研究結果類似，不同抗性向日葵品種在苗期ROS清除酶均呈現先升高后下降的趨勢。此外，野豌豆抗病品種Popany感染O.aegyptiaca后過氧化物酶活性增加2倍，且發生時間在接種后24～72 h[22]；在接種向日葵列當24 d后，抗病品種‘同輝31號’根系的POD、CAT和SOD活性分別是感病品種‘關爾一號’的1.66、1.66、2.04倍[23]。本研究結果和上述研究結果非常一致。

本研究發現誘抗劑可以促進向日葵根系細胞中胼胝質的沉積量增加，而胼胝質沉積能夠在結構水平上抵御列當對寄主根系的侵染。植物細胞的栓化和木質化常常與ROS形成有關[24]，胼胝質在質膜和細胞壁間胞間連絲大量沉積，對列當與向日葵維管束建立聯系起到了阻止作用。Sira等[25]在抗病品種HE-39999中檢測到胼胝質積累以及細胞壁加厚等現象，胼胝質沉積與POD和H2O2的活性有著緊密的聯系[26]。在抗性互作過程中，ROS的解毒過程被強化，表明列當的侵染可能使向日葵體內發生氧化迸發[27]，從而有利于向日葵抗性的建立。

采用qRT-PCR分析了7個基因的表達量。與清水對照組相比，施用誘抗劑使LOX(JA的響應基因)和ACCO1(ETH的響應基因)以及PAL(苯丙氨酸的響應基因)和PR1(SA的響應基因)表達量顯著上調，表明施用‘錦苗標靶’后SA和JA信號路徑均參與了誘導向日葵抗性的建立過程。而Sendon等[28]發現，SA和JA在誘導植物自身防御反應抵御病原物的過程中發揮著拮抗作用。但也有報道擬南芥在抵抗O.ramosa侵染時JA和ETH等合成路徑被激活，且誘導lox1、lox2和pal1上調表達，但SA路徑未被激活[29]；而三葉草對O.minor的抗性反應是通過SA而非JA途徑[30]。此外，也有研究表明，番茄與P.ramosa互作過程中，JA、SA以及ABA途徑的相關基因表達量顯著上升，這些防御激素協同參與調控寄主的防御反應[31]；殼寡糖誘導擬南芥突變體植株中SA和JA途徑相關基因的表達量較病菌侵染組均明顯升高[32]。因此，ETH、JA和SA在調節寄主對脅迫響應過程中可能存在相互協同或者相互拮抗的作用。本研究中向日葵被寄生時，JA、SA和ETH路徑的基因表達量均上調，這可能是列當在侵染向日葵的過程中引起寄主多種防御激素協同作用的結果。而向日葵抗性品種PHS1102在被列當寄生后，相對于其他抗性品種抗性機制被激活的較晚一些[33]，本試驗JK103的抗性基因相對表達量在檢測時間內上調表達較低的原因可能與抗性激活時間較晚有關。

本研究從生理生化和結構抗性等方面探究了新型誘抗劑‘錦苗標靶’對不同向日葵品種的誘抗作用，同時，抵抗列當寄生是向日葵自身的動態防御過程，抗性機制非常的復雜。后續，還需對‘錦苗標靶’抑制向日葵列當寄生的田間高效施用體系進行進一步的完善和細化，通過細胞生物學和分子實驗闡明‘錦苗標靶’誘導向日葵抗性建立的機制，繪制出其誘導向日葵抗性建立的信號圖譜。