肌萎縮側索硬化相關標志物及發病機制的研究進展

司馬旦旦，潘衛東，桂麗卿，鄭煊璐

肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種致命的進行性成人運動神經元疾病，病程進展迅速，病人多在發病后數年內因進行性呼吸肌麻痹死亡。從1993年第1次證實超氧化物歧化酶1(SOD1)為ALS的相關基因至今，目前已發現超過30個ALS相關基因。然而，超過90%的ALS病人為散發性，并不攜帶ALS相關基因。分析ALS密切相關標志物對明確ALS發病機制及開發ALS潛在治療藥物均具有重要意義[1]，故本研究對ALS相關標志物的研究進行綜述。

1 ALS的可能致病機制

RNA依賴腺嘌呤脫氨酶(ADAR) N端有2個或3個將腺苷(A)轉化為肌苷(I)的雙鏈RNA(dsRNA)結合域。目前在哺乳動物中，已確定3個結構相關的ADAR家族成員(ADAR1、ADAR2和ADAR3)。其中，ADAR2的下降是散發性ALS病人運動神經元的一個特征，其可能導致RNA GluA2 Q/R位點編輯的失敗、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體對Ca2+的通透性改變，從而導致運動神經元的凋亡。

大多數散發性ALS 病人運動神經元存在ADAR2的下降和mRNA GluA2 Q/R位點A～I轉換的失敗，其中ADAR2催化GluA2 Q/R位點的RNA編輯，運動神經元中ADAR2的缺乏可能引起GluA2 Q/R位點編輯缺失[2]。

在散發性ALS病人的尸檢中發現，其GluA2 mRNA在Q/R位點的編輯較正常人減少[3]。動物實驗表明，ADAR2條件性敲除小鼠表現出運動功能的進行性下降和運動神經元的進行性凋亡。而在沒有ADAR2缺陷的情況下，當小鼠的GluA2 Q/R位點正常編輯，ADAR2缺陷運動神經元的凋亡得到了緩解。該研究提示，ADAR2的缺失和GluA2 Q/R位點的失編輯與運動神經元凋亡相關[4]。

1.1 AMPA受體GluA2 Q/R部位的編輯與AMPA受體的Ca2+通透性 AMPA受體是離子型谷氨酸受體的一個亞型，由4個同型或異型的四聚體GluA亞基(GluA1到GluA4)組成。研究證實，AMPA受體所介導的運動神經元的凋亡可能存在兩種機制：AMPA受體GluA2 Q/R部位未編輯的增加和編輯的相對減少，最終引起AMPA受體Ca2+通透性的改變，導致細胞凋亡[3-7]。

GluA1到GluA4在Q/R位點均存在1個CAG序列(Q的密碼子)，但僅有GluA2在Q/R位點有R的密碼子。在ADAR2的催化下，RNA在GluA2 Q/R位點進行A-to-I的編輯：CAG序列(Q的密碼子)在 pre-mRNA作用下轉化為CIG，CIG在翻譯過程中被讀作CGG(R的密碼子)，大量攜帶正電荷的R殘基可阻止Ca2+通過AMPA受體，使AMPA受體對Ca2+不通透[2]。故AMPA受體的Ca2+通透性可能由GluA2亞基的存在或缺失決定，當AMPA受體由GluA1、GluA3或GluA4亞基組成而GluA2缺失時，其對Ca2+通透；當AMPA受體包含GluA2亞基時，Ca2+不能通過的AMPA受體。

GluR3亞基對Ca2+通透，當GluR3增加時GluA2相對減少，Ca2+通透的AMPA受體比例隨之上升。變異的SOD1 Tg小鼠運動神經元中GluA3增加，對其使用GluR3反義RNA后，其生存年限較前增加，提示運動神經元的凋亡可能由于非GluA2的AMPA受體比例增加所導致[7-8]。東京大學研究小組的ALS小鼠模型研究中同樣存在GluA3的上升，在持續脊髓蛛網膜下隙給藥過程中，給藥2周以后開始出現GluA3 mRNA表達量的上升，4～8周開始緩慢發生運動神經元的選擇性變性脫落，在此過程中GluA3以外的AMAP受體的亞基表達無變化，這一變化在使用AMPA受體拮抗劑后可以被阻止[5，9]。脊髓運動神經元的GluA2 mRNA少于其他神經元，故GluA3增加引起的GluA2比例變化更易對運動神經元產生影響。然而條件性敲除小鼠的GluA2時，并未觀察到運動神經元的凋亡[9]，提示AMPA受體的改變可能僅是運動神經元凋亡的不利因素。

1.2 AMPA受體對Ca2+的通透所導致的核-質轉運的中斷 運動神經元病中可能存在Ca2+失調引起的核質轉運功能障礙。在Akamatsu等[10-11]的研究中，當ADAR2缺陷小鼠運動神經元的AMPA受體對Ca2+通透時，鈣蛋白酶被錯誤定位于細胞核，并裂解核孔蛋白(nucleoporins，Nups)。當神經元核孔復合物(nuclear pore complex，NPC，包括核層和Nups)被蛋白酶降解時，過量的Ca2+流入細胞核，破壞正常的核-質轉運。同時由于核膜對Ca2+的通透，核質中Ca2+水平出現變化，并影響了基因的表達。該研究證明，運動神經元病病人的運動神經元中可能存在一種鈣蛋白酶介導的病理機制。ADAR2的逐步下降是散發性ALS病人運動神經元的一個特征，但導致細胞凋亡的下游事件可能是Ca2+的過量內流。其可能導致鈣蛋白酶的錯誤激活，并降解包括反式激活應答DNA結合蛋白43(transactivation response DNA-binding protein 43，TDP-43)和Nups在內的生理功能分子。

散發性ALS病人和ADAR2缺陷小鼠的運動神經元中均有發現被鈣蛋白酶降解的Nups和其他核-質轉運元件，證明ADAR2下降的下游，存在因RNA代謝失調導致的細胞核重要的生理蛋白功能的改變，影響正常的核-質轉運，從而間接影響基因表達，最終導致運動神經元的凋亡[10]。

1.3 病理性TDP-43在ALS中的致病機制 TDP-43是一種核蛋白，由 414 個氨基酸構成，生理狀態下僅在核內發揮作用，參與轉錄調控和選擇性剪接。因1號常染色體的TARDBP(transactive response DNA-binding protein gene)基因編碼被命名為TDP-43。多數ALS病人皮質和脊髓中存在高度磷酸化的病理性TDP-43聚集體[12]。

正常情況下，TDP-43蛋白多分布在核內，僅少量分布在胞質。TDP-43的異常和錯誤定位是較為公認的散發性ALS病人和部分家族性ALS病人的病理指標。其中，TDP-43病理包括TDP-43從細胞核向細胞質的錯誤定位、異常胞質包涵體的形成，和異常病理組織中異常碎片化和磷酸化[13-14]。此外，病理性TDP-43并不局限于ALS運動神經元，阿爾茨海默病、創傷性腦損傷、海馬硬化癥、路易體癡呆等的神經系統疾病中也能觀察到這種現象。

研究表明，ARDR2缺陷小鼠表現出TDP-43從細胞核到細胞質的錯誤定位，類似于ADAR2缺陷運動神經元的病理性TDP-43。通過蛋白免疫印跡法(Western Blot)證明，TDP-43特異性地被一種Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶切割后的TDP-43片段與AR2小鼠運動神經元組織中的TDP-43片段呈現出相似的分子帶[8，10]。提示TDP-43的錯誤定位可能是鈣蛋白酶錯誤定位于細胞核的下游事件。由于GluA2 Q/R位點RNA的編輯失敗，Ca2+通過AMPA受體過量流入核內，激活的鈣蛋白酶和由此產生的TDP-43碎片在胞質中聚集形成包涵體，導致TDP-43從細胞核向細胞質的錯誤定位和異常胞質包涵體的形成[15-16]。

病理性TDP-43作為散發性ALS的病理診斷標志被逐漸認可，然而病理性TDP-43僅是運動神經元病病人ADAR2下降導致運動神經元凋亡的下游事件或在運動神經元病的病理機制中發揮作用，現在仍未完全明晰。目前存在兩種假設，即功能獲得假設和功能缺失假設：病理性TPD的錯誤定位和異常包涵體的形成可能通過細胞毒性作用誘發了運動神經元的凋亡；或TDP-43的錯誤定位使核內原有的部分功能缺失，最終導致神經元的凋亡。

生理狀態下，TDP-43存在于核內，參與RNA的代謝過程[15]。當TDP-43錯誤定位于核外時，TDP-43的功能缺失，動力蛋白激活蛋白1(Dynactin1)水平降低，自噬體-溶酶體的融合被抑制，不成熟的自噬囊泡積累，自噬過程收到抑制[17]，異常聚集的TDP-43蛋白降解減少并在胞質中積累形成異常包涵體。TDP-43同時具有剪切調節作用，TDP-43與囊性纖維化跨膜傳導調節基因(CTFR)外顯子9附近的3′剪切點的TG重復序列結合并導致外顯子跳躍，使mRNA轉錄為不同的蛋白質。TDP-43條件性敲除小鼠與ALS病人大腦中可檢測到隱秘外顯子的剪切碎片。隱秘外顯子可選擇性降解包含提前終止翻譯密碼子的mRNA，當TDP-43功能的缺失時，參與核轉入的RANBP1和參與自噬的ATG48的隱秘外顯子被剪切，TDP-43被錯誤定位于核外[17-18]。而TDP-43過表達的脊髓運動神經元中存在神經毒性作用，軸突出現去束化、短截化，軸突的完整性受損[19]，其可能導致運動神經元的退行性改變，并最終導致疾病的發生和進展。最新研究發現，TDP-43的D169G位突變能嚴重影響TDP-43的分離和核體組裝，以致細胞應激時大量TDP-43從核內轉移至胞漿，同時D169G突變的TDP-43的運動神經元和果蠅模型中，均表現出較野生型TDP-43更強的細胞毒性和神經退化表型[20]。

2 ALS的潛在治療藥物

利魯唑是目前唯一的一線用藥，被認為能抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受體和AMPA受體的興奮性突觸后效應，減少谷氨酸釋放，降低神經元的興奮性[21]，有可能延緩病程、延長ALS病人的生存期，但證據尚不明確。除此之外，基于其他靶點的潛在藥物仍在研究。

ADAR2條件性敲除小鼠實驗證實，通過腺病毒相關(AAV)載體來傳遞ADAR2基因或口服AMPA受體拮抗劑，可上調ADAR2的表達和GluA2 Q/R位點的RNA編輯，從而減少ADAR2條件性敲除小鼠的運動神經元的凋亡和病理性TDP-43的錯誤定位。然而目前基因治療尚無進展，AMPA受體拮抗劑作為ALS的潛在治療藥物存在更多可能。吡侖帕奈是一種新型的AMPA受體拮抗劑，目前已作為抗癲癇藥物批準上市，可選擇性地減弱Ca2+通過AMPA受體流入，降低AMPA受體對Ca2+的通透性[22]。動物實驗證實，給予AR2H和AR2小鼠口服吡侖帕奈14 d，可使運動神經元中的病理性TDP-43正常化，并在90 d后明顯阻止AR2小鼠和TDP-43病理相關的運動神經元凋亡進程[10]。目前東京大學已開展吡侖帕奈的臨床相關實驗，但相關結果尚未發布。