中醫藥靶向TLRs治療中樞神經系統疾病研究進展

劉欣，邵衛，陳國華*

(1.湖北中醫藥大學中醫臨床學院，湖北 武漢 430065；2.武漢市第一醫院，湖北 武漢 430000)

近年來越來越多的證據表明不同中樞神經系統疾病均涉及免疫炎癥發病機制，從有菌的顱內感染性疾病到包括腦血管病、神經退行性疾病和神經自身免疫性疾病在內的無菌性腦炎癥損傷，神經炎癥成為其發生發展的重要病理基礎[1]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為模式識別受體中的重要一員，在中樞神經系統包括小膠質細胞、星形膠質細胞等在內的免疫細胞上均有表達，能夠識別各種外源性和內源性分子，進一步介導神經炎癥的產生[2]。特異性靶向TLRs可能是免疫炎癥相關中樞神經系統疾病中調節神經炎癥的一個重要策略。雖然目前已有研究者設計出針對不同TLRs信號通路的新分子，但大多局限于其他系統疾病，在中樞神經系統疾病僅有少數研究[3]。而中醫藥往往通過多途徑、多靶點起效，在抗炎等方面能發揮重要作用，目前尚無關于這一主題的全面綜述。我們以TLRs信號通路與不同中樞神經系統疾病的關系為切入點，對近些年來有關中醫藥通過干預TLRs信號通路治療各種免疫炎癥機制相關中樞神經系統疾病研究進展作一綜述。

1 TLRs簡述

TLRs是存在于哺乳動物中的果蠅Toll蛋白同源物，是一種I型跨膜蛋白，由3個具有特定作用的成分組成,即富含亮氨酸重復區胞外域、跨膜區和胞質內Toll白介素-1受體結構域(TIR結構域)。迄今為止已發現13種不同的TLRs，其中在人體免疫細胞和非免疫細胞的質膜上或核內體/溶菌酶中找到10種TLRs(TLR1-TLR10)，在小鼠中發現了12種TLRs(TLR1-TLR9,TLR11-TLR13)。TLRs能與細菌、細菌產物、病毒、鞭毛蛋白等病原相關分子模式，以及在細胞損傷和壞死時被釋放的內源性配體(也稱為損傷相關分子模式)結合引發先天性免疫應答，進一步在適應性免疫應答的激活中發揮關鍵作用[4]。而TLRs信號通路主要由胞內接頭蛋白如髓樣分化因子88(MyD88)、髓樣分化因子88樣銜接蛋白、誘導干擾素β包含TIRs結構域的接頭分子(TRIF)和TRIF相關銜接分子等介導，可分為依賴MyD88和依賴TRIF兩種通路。除了TLR3，其余TLRs主要通過MyD88依賴通路進行信號轉導。MyD88介導的信號通路一般有3個方面功效：增加促炎細胞因子的產生，啟動絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯反應，刺激干擾素調節因子激活[5]。

2 TLRs與腦血管病

2.1 TLRs與腦血管病的關系

腦血管病作為中樞神經系統中最常見的疾病,具有較高的發病、致殘及致死率。不論是缺血性還是出血性腦血管病，其發生、發展過程均涉及炎癥細胞侵襲聚集、細胞因子上調等，TLRs作為腦內激活先天免疫系統的重要介質，通過與缺血或出血時釋放的內源性和外源性分子相互作用介導了神經炎癥發生，進一步損傷腦組織，被認為是預防腦血管病繼發性腦損傷的潛在靶點[6]。據文獻報道TLRs家族中TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9似乎均參與了缺血性或出血性腦卒中后的炎癥損傷，其中TLR4在腦血管病腦損傷的病理發展過程中比其他TLRs更為重要[7]。Sara Palma-Tortosa等[8]分析發現TLR4的激活在小鼠缺血性卒中后可能通過增加基質細胞衍生因子1-α和腦源性神經營養因子表達來促進神經干細胞的增殖和遷移，進一步調節神經修復中風后腦損傷。Parada E等[9]研究表明TLR4/NF-κB信號通路在腦缺血再灌注(I/R)損傷的發展過程中被明顯激活，而抑制TLR4激活則能通過減少神經炎癥相關因子的產生發揮神經保護作用。而另有研究發現不同的TLR4拮抗劑可保護腦I/R損傷或蛛網膜下腔出血小鼠模型的大腦，TLR4可能是改善缺血性或出血性卒中的有效靶點[10-11]。因此TLRs與腦血管的發生發展密切相關。

2.2 中醫藥干預TLRs治療腦血管病

中藥單藥或其提取出的有效活性成分，可靶向TLRs改善缺血性或出血性腦血管病炎癥反應的發生。研究發現丹參和川芎聯合用藥可能通過減輕參與動脈粥樣硬化以及相關腦血管損傷的巨噬細胞和內皮細胞中TLR1/2、TLR3和TLR4激活的炎癥反應來治療動脈粥樣硬化相關的腦血管疾病[12]。另有研究[13]發現姜黃素干預能明顯降低永久性大腦中動脈閉塞大鼠模型神經功能缺損評分、腦梗死面積、神經元損傷、腦含水量和髓過氧化物酶活性，且抑制了大鼠腦內TLR2/4的表達，降低NF-κB p65的表達及血液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的釋放，說明姜黃素可能通過抑制TLR2/4-NF-κB信號通路發揮抗炎作用來保護腦缺血的神經損傷。Xue Lai等[14]研究發現肉蓯蓉提取物毛蕊花糖苷能改善急性腦出血模型小鼠的行為評分，減少繼發性腦損傷如血腫體積、腦水腫和神經元凋亡，然而體內和體外TLR4的敲除都能消除毛蕊花糖苷的上述作用，因此TLR4可能介導了毛蕊花糖苷發揮的神經保護作用。同樣，其他研究者發現β-廣藿香烯、銀杏二萜內酯、五味子苷B、丹參酚酸B、葛根素等其他中藥活性成分均可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來減輕腦I/R損傷模型鼠神經缺損評分和梗死面積，對其發揮神經保護作用[15-18]。

3 TLRs與阿爾茲海默病

3.1 TLRs與阿爾茲海默病的關系

阿爾茨海默病(AD)是老年人群中最常見的神經退行性疾病，主要表現為認知功能障礙，伴精神行為異常和日常生活能力障礙。然而近一個世紀的研究仍然未能明確AD的病因及發病機制，隨著研究者發現AD的主要病理標志物β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積斑塊周圍有活化的小膠質細胞等聚集，AD患者及動物的腦內也發現了細胞因子、趨化因子等炎癥指標明顯升高，且流行病學研究提示接受抗炎藥物長期治療的AD患者顯示出病程進展變緩的療效，這些證據都表明神經炎癥在AD的發生發展中占有重要地位[19]。進一步的研究發現在AD腦內先天免疫細胞通過包括TLRs在內的各種先天免疫受體識別Aβ斑塊，從而介導了神經炎癥的發生[20]。早期研究者已經發現AD患者死后大腦中老年斑周圍的小膠質細胞中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9和TLRs共受體CD14的表達增加[21]。Zhang Wei等[22]發現AD患者外周血單核細胞TLR2表達增加，且TLR2水平與大腦功能呈負相關，因此認為血清TLR2水平有望成為AD的外周血標志物。近年來Walker等[23]研究發現人類AD大腦中與Aβ斑塊相關的小膠質細胞中TLR3表達增加。至于TLRs在AD中的具體作用，目前研究最多的主要是TLR2、TLR4和TLR9，其中TLR2與TLR4均介導雙重作用，即在AD的病理過程中表現出促炎和抗炎兩種作用，有研究者考慮與AD處于疾病不同階段有關來解釋這一爭議，即在AD的初始階段TLR2/4發揮抗炎作用，介導Aβ的清除，而在AD的后期階段，慢性刺激下TLR2/4則發揮促炎作用，加劇Aβ的沉積；TLR9則主要起到神經保護作用[24]。

3.2 中醫藥干預TLRs治療阿爾茲海默病

中醫藥在以TLRs為靶點來干預AD方面也有相應的研究。Wang Xuerui 等[25]發現使用含有16種中草藥的腦心通膠囊干預能改善APP/PS1小鼠認知行為學障礙，同時降低腦內磷酸化微管相關蛋白和Aβ積累，并抑制神經元萎縮和凋亡，進一步的機制研究發現腦內TLR4及炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB均下降，因此腦心通膠囊可能通過抑制TLR4/NF-κB/IL-1β信號通路來對AD發揮神經保護作用。Qi Yue 等[26]研究發現文冠果殼苷能改善Aβ1-42誘導小鼠的空間損傷，并抑制小鼠海馬中膠質細胞活化標志物及炎性因子的過表達，降低海馬TLR2mRNA水平，阻斷NF-κB p50和p65易位進入細胞核和細胞外信號調節激酶的磷酸化,且降低了氨基端激酶的表達，說明文冠果殼苷改善學習和記憶障礙可能與下調TLR2及下游信號通路中MAPK和NF-κB介導的炎性反應有關。Zhou Zhangjiuzhi等[27]通過對6～7個月的APP/PS1小鼠給予90d的杜仲樹皮提取物京尼平苷酸干預，發現其改善了APP/PS1小鼠的學習和記憶功能，并減輕了Aβ斑塊沉積及神經炎癥，潛在機制可能是其在抑制膠質細胞活化而減少高遷移率族蛋白(HMGB-1)表達的情況下阻斷了反應性小膠質細胞的TLR2-MyD88信號通路。

4 TLRs與帕金森病

4.1 TLRs與帕金森病的關系

帕金森病(PD)是第二類最常見的神經系統退行性疾病，其典型病理特征是黑質致密部多巴胺能神經元丟失及α-突觸核蛋白(α-synuclein)聚集的路易小體形成。雖然PD的病因仍不清楚，越來越多的證據表明大量酶和受體參與的神經炎癥與PD的發生發展密切相關，其中TLRs介導的內源性積累的α-synuclein誘導的小膠質細胞激活及炎癥反應在PD中起重要作用[28]。Drouin-Ouellet J等[29]研究發現TLR2和TLR4在PD患者及小鼠模型血液和大腦中的表達水平明顯升高。王國輝等[30]通過臨床研究發現PD患者血漿HMGB-1、TLR4和NF-kB水平與健康人群相比明顯升高，且與PD臨床分期呈正相關，可能成為未來判斷PD發病和分期的生物標志物。此外隨著全基因組測序的開展，Zhao J等[31]研究發現漢族人群攜帶的TLR4基因可能增加其罹患PD的可能性。除了TLRs及其信號通路相關分子在PD中表達有差異外，研究者也通過TLRs特異性抗體的拮抗或基因的沉默進一步證明了TLRs與PD密切相關。谷有全等[32]研究發現使用TLR4單克隆抗體干預的1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導的PD模型小鼠與模型組相比，其TLR4陽性細胞及CD11b陽性小膠質細胞數量明顯降低，小鼠中腦TLR4、TNF-α及IL-1βmRNA均降低，從而說明了TLR4及小膠質細胞可能介導了PD神經炎癥的發生。Conte Carmela等[33]研究發現，TLR4基因缺陷小鼠相比于野生型小鼠難以被MPTP誘導發生PD相關運動障礙及病理特點。Michela Campolo等[34]研究發現TLR7/8在MPTP誘導的PD小鼠模型中明顯升高，且與PD模型組相比，TLR7/8基因缺失改善了PD小鼠的行為障礙，并減少了小膠質細胞和星形膠質細胞的激活及炎性因子的表達，說明通過拮抗TLR7和TLR8可能成為治療帕金森病的一個潛在靶點。

4.2 中醫藥干預TLRs治療帕金森病

中醫藥干預TLRs治療PD也有較多研究。諶盈帆等[35]使用補腎活血方干預腹腔注射MPTP法構建的PD模型小鼠發現，與模型組比較中藥組小鼠在爬桿試驗和Morris水迷宮試驗中爬下時間減少，逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，且小鼠酪氨酸羥化酶陽性神經元數目增加，TLR4、NF-kB p65、IL-6、TNF-α的表達均下調，因此補腎活血方可能通過抑制TLR4/NF-kB信號通路及其下游炎癥因子來改善PD小鼠運動障礙。周甜甜等[36]基于“腦-腸軸”理論發現使用天麻中分離出來的新型聯芐化合物20C干預明顯減少了MPTP誘導的PD小鼠胃和小腸中聚集型、硝基化α-synuclein的含量及TLR4、p-p65、IL-1β水平，說明20C可能通過抑制TLR4/NF-κB p65通路減輕胃腸道炎癥反應，繼而降低胃腸道病理性α-synuclein的生成及其沿“腦-腸軸”向中樞神經系統的傳播，從而對PD小鼠發揮保護作用。陰俊俊[37]通過免疫熒光染色發現銀杏內酯B減少了PD細胞模型及小鼠模型的離子鈣接頭蛋白+TLR4+及膠質纖維酸性蛋白+TLR4+的表達,并降低了TNF-α表達，因此銀杏內酯B可能通過抑制神經膠質細胞活化及TLR4介導的相關炎癥因子表達來保護PD黑質多巴胺能神經元。孫瑩[38]研究發現蟲草素可能通過抑制TLR4/NF-KB/NLRP3信號通路的激活來抑制脂多糖誘導的PD模型神經炎癥和細胞焦亡,從而對多巴胺能神經元發揮保護作用。Jing Yang等[39]研究發現黃芪提取物毛蕊異黃酮可能通過抑制TLR2/4-NF-κB通路和MAPK通路減輕PD小鼠行為功能障礙，同時抑制了多巴胺能神經元的丟失和小膠質細胞活化，改善了神經炎癥反應。

5 TLRs與多發性硬化癥

5.1 TLRs與多發性硬化癥的關系

多發性硬化癥(MS)是中樞神經系統自身免疫性疾病，以慢性炎癥、脫髓鞘、軸突和中樞神經系統的神經元喪失為特征，其確切病因及發病機制仍未明，目前多認為免疫功能異常在其發病中起著關鍵性作用，而TLRs作為腦內先天免疫受體可能介導了多發性硬化癥相關的炎癥反應。S.B.Patten等[40]發現MS患者大腦中TLR2、TLR4和小膠質細胞增生的mRNA表達升高。Dalia Ahmed Labib等[41]采用流式細胞術檢測發現與健康者相比，TLR2在MS患者淋巴細胞和中性粒細胞的表達顯著升高，而TLR4僅在淋巴細胞的表達顯著升高，且TLR-2和TLR-4的表達均有相應的敏感性和特異性。Pavan Bhargava等[42]比較了MS患者和健康者之間循環細胞外囊泡上的表面蛋白之間的差異，發現與健康者相比，TLR4濃度較高。上述研究為MS提供了潛在的生物標志物。研究者通過進一步研究發現了TLRs參與MS的潛在機制。Fletcher J M等[43]發現適應性免疫T輔助細胞Th17和Th1進入腦組織后能通過TLR4識別髓磷脂蛋白被激活，導致促炎細胞因子IL-6和IL-23的分泌而在MS中發揮致病作用。其他研究表明腦組織中的TLR配體通過細胞內信號轉導激活TLRs，主要是TLR3和TLR4，引起炎癥因子干擾素-γ(IFN-γ)和IL-17的分泌增加，直接導致MS的發生[44]。Ying Zhang等[45]發現TLR4缺失不僅難以構建實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型(EAE)，而且抑制了EAE小鼠病變區域炎癥因子和趨化因子CCL25的分泌，且Th17細胞中CCR9的表達減少，趨化遷移減弱，因此認為TLR4可能通過CCL25/CCR9信號介導Th17浸潤來參與EAE發病。

5.2 中醫藥干預TLRs治療多發性硬化癥

部分西藥的研究顯示其可能通過抑制海馬區TLR2/TLR3/TLR4介導的炎性因子的表達來改善MS小鼠的行為障礙及病理上腦組織髓鞘的丟失[46]，中醫藥也有相應的研究。Abdin等[47]使用雷公藤根中提取物雷公藤紅素干預EAE小鼠發現其能降低其臨床評分，且大腦中TLR2蛋白的表達明顯降低。Kim Min ju 等[48]發現紅豆活性提取物齊墩果酸醋酸能改善EAE小鼠后肢癱瘓及脊髓內炎癥細胞浸潤，并阻斷EAE小鼠脊髓中TLR2及其下游促炎細胞因子的上調。因此雷公藤紅素和齊墩果酸醋酸可能均通過抑制EAE中TLR2信號通路介導的神經炎癥來起效。Alyria Teixeira Dias等[49]發現EAE小鼠脊髓中TLR3、TLR9水平較正常對照組降低，而使用槐角中提取出的活性成分染料異黃酮干預后增加了EAE小鼠脊髓中TLR3、TLR9、IFN-β表達，減少TH1、Th17細胞因子表達來延遲疾病的發作，并減少了脊髓中炎癥浸潤和脫髓鞘，說明染料異黃酮可能預防多發性硬化癥的發生。李玥珺[50]研究發現通過二次免疫法建立的實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型大鼠相較于正常對照組腦組織中TLR2/TLR4表達增多，而溫膽湯干預后可降低大鼠腦組織TLR2/TLR4的表達，并降低了細胞因子IL-2、IFN-α的表達，說明溫膽湯改善EAE臨床癥狀及病理改變可能與TLRs通路有關。何新新等[51]發現肉桂的主要成分肉桂醛可抑制TLRs的活性，具有顯著的抗炎作用，在MS的治療中發揮積極作用。

6 展望

腦血管病、AD、PD、MS雖然屬于不同的中樞神經系統疾病，但卻基于相同的免疫炎性病理基礎，本文結合現有研究所探討的TLRs與中樞神經系統疾病的聯系主要表現在兩個方面，其一是TLRs在中樞神經系統疾病中出現相對于健康者的血液或組織中差異表達；其二是通過使TLRs過表達或沉默的方法發現上述疾病臨床癥狀和病理特征的改善或惡化來體現TLRs的潛在作用機制，從而說明了TLRs可能成為免疫炎癥相關中樞神經系統疾病的有效干預靶點。進一步通過中藥或其活性成分干預疾病細胞或動物模型來發現其靶向TLRs的潛在價值，為中醫藥干預TLRs治療與免疫炎癥相關中樞神經系統疾病提供了實驗依據。雖然目前已開展基于神經炎癥機制的流行病學研究、非甾體類抗炎藥及其他抗炎藥物治療能降低神經系統疾病發生的風險,但其療效和作用機制仍需要進行深入研究。而中藥因其療效明確，成分清晰，具有多環節、多靶點、多途徑等作用特點，且不良反應較小，在治療免疫炎癥相關中樞神經系統疾病方面發揮著越來越大的作用，未來可以在中醫藥中開發以TLRs為靶點的激動劑或拮抗劑，或調節其下游信號通路，探討全新的對抗神經炎癥治療手段。