蟲草素對脂多糖誘導的急性肺損傷模型大鼠的保護作用及TLR4/NF-κB 通路的影響

李君明 盛 燚 洪志星 詹玉飛

急性肺損傷（ALI）是由直接和間接致傷因素引起的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全，嚴重者可發展為急性呼吸窘迫綜合征，具有較高死亡率[1]。ALI 的致病因素較多，臨床上主要采用呼吸支持、糖皮質激素等手段治療[2]。目前尚缺乏治療ALI 的有效藥物。Toll 樣受體4（TLR4）是一種跨膜蛋白，是Toll 樣受體家族的成員之一，TLR4激活會導致細胞內核因子-κB（NF-κB）信號轉導并產生炎性細胞因子[3]。研究表明，TLR4/NF-κB 信號通路參與膿毒癥ALI 大鼠的生理進程，抑制其表達能夠減輕膿毒癥大鼠肺組織炎癥反應[4]。蟲草素又稱冬蟲夏草素，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和免疫調節等生物活性[5]。有研究顯示，蟲草素對創傷性腦損傷大鼠神經元具有保護作用[6]。而有關蟲草素對ALI 的影響和機制的研究鮮有報道。本研究擬探討蟲草素對大鼠ALI 的作用及TLR4/NF-κB 通路的影響，為ALI 的治療提供藥物研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級成年SD 大鼠60 只（雌雄各半，體質量200～250 g）從浙江大學實驗動物中心[許可證號：SCXK（浙）2020-0018]獲得，將大鼠飼養在標準條件下的籠子中，溫度為22～25 ℃，相對濕度為50%～60%，進行12 h 的明暗循環，并可以自由獲取水和食物。本研究經醫院倫理委員會審核通過。

1.2 主要試劑與儀器 蟲草素（成都嘉葉生物科技有限公司，原料藥，純度99.9%，批號73-07-2，用生理鹽水配制成濃度分別為0.5、1、2 mg/mL 的蟲草素溶液）；脂多糖（LPS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）酶聯免疫吸附檢測試劑盒、蘇木素伊紅（HE）染液（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號BC-K1078-S、BC-K119-S、BC-K135-S、BC-L172-S、BC-L192-S）；TRIzol 試劑、逆轉錄試劑盒、蛋白提取液（北京全式金生物技術有限公司，批號AE308-04、AT101-07、AL208-09）；PCR 試劑盒、BCA 蛋白質測定試劑盒、TLR4、NF-κB、GAPDH 單克隆抗體、兔抗鼠二抗（北京百邁客生物科技有限公司，批號RK07002、RK01069、RK02004、RK09005、RK10004、RK08011）；血氣分析儀（上海雷度米特醫療設備有限公司，型號IDEXX）；顯微鏡、PCR 儀、凝膠成像系統（南京伊若達儀器設備有限公司，型號E260、MA6000、G15T8E）。

1.3 造模、分組和給藥 參照文獻[7]的方法，48 只大鼠尾靜脈注射5 mg/kg 的LPS 0.5 mL 建立ALI 模型。隨機分成模型組、蟲草素低（5mg/kg）、中（10 mg/kg）、高（20 mg/kg）劑量組[8]，每組12 只。另外取12 只大鼠尾靜脈注射0.5 mL 生理鹽水設為對照組。造模成功后，蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素溶液（濃度分別為0.5、1、2 mg/mL，注射體積10 mL/kg）；模型組和對照組大鼠腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；每天1 次，連續給藥1 周。

1.4 動脈血氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2）水平檢測 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取大鼠股動脈血，采用血氣分析儀檢測PaO2和PaCO2的水平。

1.5 肺組織炎性因子水平檢測 頸脫臼處死大鼠，獲取右肺下葉組織，生理鹽水沖洗，勻漿化，4 ℃下8000 rpm 離心10 min，收取上清，采用試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

1.6 肺組織形態學觀察及肺損傷評分 獲取右肺上葉組織，甲醛固定，將樣品包埋在石蠟中，然后切成4 μm 切片，并用HE 染液染色，光學顯微鏡觀察肺組織形態學。根據以下四個項目對大鼠肺損傷進行評分：水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡壁紅細胞滲漏、肺泡壁厚度；每個項目根據嚴重程度（由輕到重）依次為0～4分，得分越高表示肺損傷越嚴重[9]。

1.7 肺組織TLR4、NF-κB 信使核糖核酸（mRNA）水平檢測 使用TRIzol 試劑從上述勻漿化的右肺下葉組織中提取總RNA，逆轉錄試劑盒將獲得的RNA 反轉錄為cDNA，根據PCR 試劑盒說明書配制反應體系，通過PCR 儀進行相關反應。引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。序列如下：TLR4（正向：5′-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3′；反向：5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′）；NF-κB（正向：5′-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3′；反向：5′-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG-3′）；GAPDH（正向：5′-GCCTCGTCTCATAGACAAGATG-3′；反向：5′-CAGTAGACTCCACGACATAC-3′）。PCR 擴增條件如下：95 ℃持續2 min，然后進行40 個循環（95 ℃持續15 s，60 ℃持續20 s，73 ℃持續10 s）。使用2-ΔΔCt相對定量方法計算TLR4、NF-κB mRNA 水平。

1.8 肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平檢測 使用蛋白提取液從上述勻漿化的右肺下葉組織中提取總蛋白，并在4 ℃下以12000 rpm 離心10 min，通過BCA蛋白質測定試劑盒評估總蛋白質濃度，將每孔等量的總蛋白上樣到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳反應，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，在室溫下用5%牛血清白蛋白封閉2 h。將膜與1∶800稀釋的TLR4、NF-κB、GAPDH 一抗在4 ℃孵育12 h，添加二抗繼續孵育2 h。通過增強的化學發光試劑盒檢測蛋白條帶，用光密度法評估信號并將其標準化為GAPDH 蛋白。

1.9 統計學方法 應用SPSS 24.0 軟件進行統計分析，符合正態分布計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠PaO2和PaCO2水平比較 與對照組比較，模型組大鼠PaO2水平降低，PaCO2水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠PaO2水平依次升高，PaCO2水平依次降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠PaO2 和PaCO2 水平比較（mmHg，）

表1 各組大鼠PaO2 和PaCO2 水平比較（mmHg，）

注：對照組、模型組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素；PaO2 為動脈血氧分壓；PaCO2 為動脈二氧化碳分壓；1 mmHg=0.133 kPa 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蟲草素低劑量組比較，cP＜0.05；與蟲草素中劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平依次降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較（pg/mg，）

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較（pg/mg，）

注：對照組、模型組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白細胞介素-6；IL-1β 為白細胞介素-1β；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蟲草素低劑量組比較，cP＜0.05；與蟲草素中劑量組比較，dP＜0.05

2.3 各組大鼠肺組織形態學及肺損傷評分比較 對照組大鼠肺泡組織結構正常；模型組肺泡組織受損，毛細血管擴張，紅細胞滲漏和肺組織液分泌，可見炎癥細胞浸潤；蟲草素干預后，肺泡組織趨于正常，肺泡壁變薄，紅細胞、分泌液減少，炎癥細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態學病理圖（HE 染色，×200）

對照組、模型組、蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺損傷評分分別為（0.00±0.00）分、（9.58±1.03）分、（6.92±0.87）分、（4.03±0.61）分、（2.19±0.33）分。與對照組比較，模型組大鼠肺損傷評分升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺損傷評分依次降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、NFκB mRNA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA水平依次降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 水平比較（）

表3 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 水平比較（）

注：對照組、模型組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素；TLR4 mRNA 為Toll 樣受體4 信使核糖核酸；NF-κB mRNA 為核因子-κB 信使核糖核酸；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蟲草素低劑量組比較，cP＜0.05；與蟲草素中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平比較與對照組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，蟲草素低、中、高劑量組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平依次降低（P＜0.05）。見表4 和圖2。

表4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平比較（）

表4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白水平比較（）

注：對照組、模型組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水；蟲草素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 的蟲草素；TLR4 為Toll 樣受體4；NF-κB 為核因子-κB；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蟲草素低劑量組比較，cP＜0.05；與蟲草素中劑量組比較，dP＜0.05

圖2 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白印跡圖

3 討論

蟲草素是從蛹蟲草中分離的活性成分，具有抗菌抗病毒、降糖降脂等多種藥理作用[10]。中醫認為，蛹蟲草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，是一種能同時平衡、調節陰陽的中藥[11]。Wei 等[12]研究顯示，蟲草素可保護創傷性腦損傷小鼠神經功能和血腦屏障的完整性，抑制炎癥反應。Zhang 等[13]研究表明，蟲草素可通過抑制NLRP3 炎癥小體表達來發揮對帕金森病模型大鼠的神經保護作用。PaO2和PaCO2水平可反映肺功能和肺泡通氣狀態，余丹等[14]研究顯示，缺血再灌注肺損傷大鼠較正常大鼠PaO2水平降低，PaCO2水平升高；右美托咪定可改善大鼠肺功能和肺組織炎癥損傷，并且使大鼠PaO2水平升高，Pa－CO2水平降低。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠PaO2水平降低，PaCO2水平、肺損傷評分升高，肺泡組織受損，毛細血管擴張，紅細胞滲漏和肺組織液分泌，可見炎癥細胞浸潤；經蟲草素治療后，ALI 大鼠PaO2水平呈劑量依賴性升高，PaCO2水平、肺損傷評分呈劑量依賴性降低，肺泡組織趨于正常，肺泡壁變薄，紅細胞、分泌液減少，炎癥細胞浸潤減少。與余丹等[14]研究結果一致，說明蟲草素可改善ALI 大鼠肺功能和肺損傷。

炎癥在ALI 的發生和發展中起關鍵作用，ALI能刺激炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的釋放，而這些炎性因子進一步增強了炎癥反應并加重了肺損傷[15]。張永紅等[16]研究發現，ALI 小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平較健康小鼠明顯升高，沙丁氨醇可抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 表達來改善小鼠的肺損傷。王瑩等[17]研究顯示，肝素可抑制ALI 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平并對ALI 大鼠具有保護作用。本研究結果發現，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平高于對照組，經過蟲草素治療后，ALI 大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平明顯降低，與上述研究結果一致，表明蟲草素可有效抑制ALI 大鼠的炎癥反應。

TLR4 是免疫反應的關鍵調節因子，而NF-κB在炎癥細胞因子的產生中起關鍵作用[18]。Peng 等[19]研究發現，積雪草苷能夠抑制TLR4/NF-κB 通路的激活來降低ALI 小鼠肺泡上皮通透性和炎癥反應。Pan等[20]研究表明，白細胞介素-35（IL-35）可抑制TLR4和NF-κB 蛋白表達來減輕ALI 小鼠肺部炎癥，而發揮保護作用。本研究結果顯示，模型組大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 和蛋白水平高于對照組，經蟲草素治療后，ALI 大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA和蛋白水平呈劑量依賴性降低，與Peng 等[19]和Pan等[20]研究結果一致。這說明蟲草素可通過抑制ALI大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 和蛋白表達進而抑制TLR4/NF-κB 通路的激活，從而減輕大鼠肺部炎癥。

綜上所述，蟲草素可改善ALI 大鼠肺功能和肺損傷，降低肺部炎癥反應，其機制可能與蟲草素抑制ALI 大鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA 和蛋白表達進而抑制TLR4/NF-κB 通路的激活有關。