基于PKA 依賴cAMP 信號介導肺胃SP 表達探討中醫肺胃相關理論的機制研究

晏露寧 汝觸會 陳愛鳳 陳 曄 韓佳穎 何 飛

臟腑同治是中醫臟腑相關理論在長期實踐中形成的臨床經驗，根據臟腑之間有無經絡屬絡的關系分為有表里關系的臟腑同治和非表里關系的臟腑同治。仲景有云：“陽明病，脈浮……宜麻黃湯。”在這里，雖是陽明經表受邪，但仍會導致肺氣不利，肺氣不宣，故宣肺解表以麻黃湯治之，這是肺胃相關及肺胃同治理論在臨床上的典型應用。本課題組前期研究已證明，通過食管內灌注鹽酸可以誘導大鼠產生氣道神經源性炎癥改變，支氣管-食管反射通路可以導致P 物質（substance P，SP）的表達發生改變，提示SP 可能是中醫肺胃相關理論的基礎之一，但SP 表達調控的機制仍不明確[1]。本研究旨在從蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）依賴環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號介導肺胃SP表達進一步探討胃食管反流模型大鼠肺、胃組織中SP 的相關性及其可能的機制，為中醫“肺胃相關”及“肺胃同治”理論提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF 級雄性6～8 周齡SD 大鼠12 只，體質量200～230 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證編號：20170005028404，許可證編號：SCXK（滬）2017-0005。實驗動物飼養于浙江中醫藥大學SPF 級動物房，飼養條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，光照12 h 明暗交替，換風次數15～20 次/h。本研究經過浙江中醫藥大學實驗管理與倫理委員會審核通過（審批號：ZSLL-2020-205），實驗動物的處置嚴格遵守浙江中醫藥大學動物實驗中心的倫理相關規定進行。

1.2 試劑 二甲苯（國藥有限公司，批號MD911521）；PBS 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）（MDL 公司，批號MD911705）；蘇木素染液（MDL 公司，批號MD911467）；DAB kit（MDL 公司，批號MD912068）；Anti-PKA beta（catalytic subunit）抗體（美國Abcam 公司，批號ab187515）；Anti-cAMP 蛋白Kinase Catalytic subunit抗體（美國Abcam 公司，批號ab26322）；Anti-SP 抗體（美國Abcam 公司，批號ab14184）。

1.3 儀器 全自動脫水機（德國徠卡公司，型號：ASP200S）；石蠟切片機（德國徠卡公司，型號：RM2235）；低溫高速離心機（美國Thermo 公司，型號：Micro17R）；電泳儀（中國天能公司，型號：EPS300）；電泳槽（中國天能公司，型號：VE180C）；轉膜儀（中國天能公司，型號：VE186）；石蠟加熱包埋系統（德國Leica 公司，型號：G1150H）；加熱磁力攪拌器（KyLin-Bell Lab Instruments 公司，型號：GL-5250A）；正置熒光顯微鏡（德國徠卡公司，型號：DM3000）；成像系統（日本尼康公司，型號：Nikon DS-U3）。

1.4 分組及造模 將12 只大鼠隨機數字表法分為兩組，即正常對照組、模型組，每組6 只。將腹腔麻醉后的大鼠取仰臥位固定，經口插入胃管至大鼠食管的中下段，模型組以8 滴/min 的速率緩慢灌注0.1 mmol/L 鹽酸溶液，每次20 min，1 次/d，連續14 d。正常對照組用PBS 代替鹽酸，方法與模型組相同。

1.5 標本采集 腹腔注射麻醉大鼠后心臟穿刺放血處死大鼠，經左心室插入導管至主動脈，含1%肝素的生理鹽水快速沖洗后用4%多聚甲醛200 mL 灌流固定。立即在冰塊上取出食管、肺及胃組織，包埋，恒冷箱冰凍切片，HE 染色。

1.5 觀察指標及測定

1.5.1 光鏡下觀察肺胃組織學變化 對HE 切片進行圖像的采集和分析：通過顯微鏡拍照（100 倍和200 倍鏡下觀察），采集分析樣本相關部位，并進行HE 半定量分析：食管炎病理分級采用中華醫學會消化內鏡學會頒布的反流性食管炎診斷標準[2]，氣道炎癥病理分級采取半定量方法評估細支氣管氣道炎癥[3]，胃黏膜炎癥程度是根據黏膜中慢性炎癥細胞的多少進行評分[4]。

1.5.2 免疫組織化學測定豚鼠肺及胃組織PKA、cAMP、SP 表達 大鼠肺、食管與胃組織分別置入10%中性甲醛中固定，取材包埋，石蠟包埋切片。石蠟切片脫蠟后行抗原修復，然后行免疫雜交。免疫雜交：3% H2O2孵育，PBS 沖洗，滴封閉液，室溫30 min（濕盒中）。用濾紙擦去，不要洗。滴加適宜濃度的PKA、cAMP 與SP 一抗（均1∶50），孵育過夜，PBS 洗去，擦去PBS。滴加生物素化二抗，室溫孵育，PBS 洗去二抗，擦去PBS。滴加工作液，室溫孵育，PBS 洗去，擦去PBS。顯色劑顯色，自來水沖洗。蘇木素復染，脫水，透明，封片后顯微鏡下觀察并測定平均光密度。

1.6 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，所有數據均符合正態分布，計量資料以均值±標準差（）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義；組間兩兩比較，方差齊性者采用兩獨立樣本t 檢驗，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H 檢驗，將“胃組織的PKA、SP 含量”與“肺組織的PKA、SP 含量”進行χ2檢驗和線性回歸分析。

2 結果

2.1 各組大鼠肺、食管、胃組織病理形態學變化以及各組大鼠肺、食管、胃組織HE 半定量分析 與正常對照組比較，模型組肺、胃及食管組織半定量評分顯著升高（P＜0.01）（見表1）；正常對照組大鼠肺組織肺泡大小正常，未見炎性細胞浸潤，模型組大鼠肺組織可見大量的炎細胞浸潤。正常對照組大鼠胃組織胃黏膜上皮光滑，未見炎細胞浸潤。模型組大鼠胃組織胃黏膜上皮出現胃黏膜下間質水腫、黏膜下可見炎細胞浸潤。正常對照組大鼠食管組織各層結構完整，黏膜厚薄適中，黏膜基底膜清楚，各層細胞排列整齊。模型組大鼠食管組織黏膜層增厚，基底細胞層及棘細胞層細胞數目增多，角化層增厚，局部黏膜基底細胞層明顯增生，部分黏膜組織向外呈乳頭樣突起。見圖1。

圖1 各組大鼠肺、食管、胃組織形態學變化（HE 染色，200倍）

表1 各組大鼠肺、食管、胃組織HE 半定量分析（分，）

表1 各組大鼠肺、食管、胃組織HE 半定量分析（分，）

注：模型組予鹽酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常對照組用PBS代替鹽酸灌注；與正常對照組比較，aP＜0.01

2.2 各組大鼠肺、食管、胃組織PKA、cAMP 與SP 的表達情況 免疫組化結果表明，與正常對照組比較，模型組大鼠肺、食管與胃組織中PKA、cAMP 與SP的蛋白表達量均顯著升高（P＜0.01）。見表2-4。

表2 各組大鼠肺、胃、食管組織PKA 蛋白表達量比較（）

表2 各組大鼠肺、胃、食管組織PKA 蛋白表達量比較（）

注：模型組予鹽酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常對照組用PBS代替鹽酸灌注；PKA 為蛋白激酶A；與正常對照組比較，aP＜0.01

表3 各組大鼠肺、胃、食管組織cAMP 蛋白表達量比較（）

表3 各組大鼠肺、胃、食管組織cAMP 蛋白表達量比較（）

注：模型組予鹽酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常對照組用PBS代替鹽酸灌注；cAMP 為環磷酸腺苷；與正常對照組比較，aP＜0.01

表4 各組大鼠肺、胃、食管組織SP 蛋白表達量比較（）

表4 各組大鼠肺、胃、食管組織SP 蛋白表達量比較（）

注：模型組予鹽酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常對照組用PBS代替鹽酸灌注；SP 為P 物質；與正常對照組比較，aP＜0.01

圖2 各組大鼠肺、食管、胃組織中PKA、CAMP、SP 表達情況（蘇木素染色，×400）

2.3 模型組大鼠肺、食管、胃組織PKA、SP 的相關性分析 以胃組織PKA 含量為自變量X，以肺組織PKA 含量為因變量Y，P＜0.05，說明因果關系成立，根據現有的數據尋找最能反映XY 關系的方程為：Y=0.073+0.639X（見表5）。回歸分析結果表明：肺組織中PKA 的含量隨胃組織PKA 含量的增加而增加。

以胃組織SP 含量為自變量X，以肺組織SP 含量為因變量Y，P＜0.05，說明因果關系成立，根據現有的數據尋找最能反映XY 關系的方程為：Y=0.107+0.321X（見表5）。回歸分析結果表明：肺組織中SP 的含量隨胃組織SP 含量的增加而增加。

表5 肺、胃組織PKA 與SP 含量線性回歸分析

圖3 肺胃組織SP 關系散點圖

圖4 肺胃組織PKA 關系散點圖

3 討論

胃食管反流引起的咳嗽是呼吸科常見病，屬于胃食管反流病的范疇[5]。可歸于中醫的“胃咳”“內傷咳嗽”等范疇，病位在肺、胃。中醫從肅肺和胃、疏肝和胃等角度入手治療取得了良好的效果[6]。

SP 是速激肽家族的成員之一，SP 通過與受體相結合的方式在神經系統、免疫系統等多種組織器官發揮作用。既往研究表明，SP 是一種誘導迷走神經相關的支氣管-食管反射通路的神經肽[7]，本課題組前期研究發現在胃食管反流大鼠模型的肺胃組織中SP 的表達含量高于正常組大鼠，可能是臟腑同治學說中肺胃相關理論的物質基礎，而P 物質參與調控的機制則需要進一步研究[1]。

在神經-內分泌-免疫網絡提出之后，越來越多的疾病被發現可能通過神經-內分泌-免疫網絡的機制調控，如胃腸道疾病[7]、糖尿病[8]等。肺組織的神經內分泌細胞被研究證實會促進肺部組織釋放神經肽、神經遞質和促進哮喘對過敏原的反應。在發育性和慢性肺部疾病中起作用，也是小細胞肺癌的起源細胞[9]。PKA、cAMP、SP 在這一網絡的信號傳遞中可能起到了重要的作用。cAMP 主要是由腺苷酸環化酶催化ATP 反應生成，而cAMP 對細胞的調節功能主要是通過激活PKA 來實現的。研究發現，激活后的PKA/cAMP信號通路，能夠促進下游靶蛋白磷酸化，促使TRPV1通道開放，Na+、Ca2+等陽離子內流增加，從而促進SP的釋放[10]。我們猜測這一通路在促進胃腸道組織釋放SP 的同時，可能在氣管、肺等組織中也發生了某些改變。因此本課題通過構建胃食管反流模型的大鼠，用免疫組化法測定肺、胃組織PKA、cAMP、SP 表達，并將結果進行相關性分析。研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肺、食管與胃組織PKA、cAMP 與SP 蛋白表達量均極顯著升高（P＜0.01）。相關性分析結果表明，直線回歸方程能夠較好地反映PKA 和SP 在肺胃表達中存在相關性，肺組織SP 的含量隨著胃組織SP 的含量的增加而增加，肺組織PKA 的含量隨胃組織PKA 的含量增加而增加。由此我們推斷，在胃食管反流模型大鼠體內，PKA/cAMP 信號通路開放，從而使肺胃組織釋放神經肽類SP，這或許能夠從實驗層面為中醫肺胃相關及肺胃同治理論提供基礎。本課題擬下一步從治療干預角度設計研究，進一步證實PKA 依賴cAMP 信號介導肺胃SP 表達的相關情況。