北海紅樹林內生真菌Aspergillus sp.GXIMD00016的抗炎次級代謝產物*

肖澤恩，黃錫山，韋蔚烜，陸務玲，譚振，劉永宏

1. 廣西中醫藥大學海洋藥物研究院/藥學院，廣西 南寧 530200

2. 廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200

3. 廣西師范大學化學與藥學學院，廣西 桂林 541000

紅樹林內生真菌一直是海洋天然產物研究的熱點之一［1］。曲霉Aspergillus，作為目前被研究得最廣泛的紅樹林真菌菌屬，為大量骨架新穎、活性顯著的次級代謝物的產生提供了無限的可能，是發現先導化合物的重要資源［2］。朱偉明課題組［3］從1 株 紅 樹 林 內 生 真 菌Aspergillus ustus094102 中獲得18 個ophiobolin 衍生物，其中有10個化合物對G3K、MCF-7、MD-MBA-231、MCF/Adr、A549 和HL-60 癌細胞顯示出細胞毒性，IC50值在0.6～9.5 μmol/L 之間。文獻［4］從Aspergillus versicolorHDN1009 中獲得了6 個獨特的二聚體versixanthones A～F，這些二聚體對7 種受試癌細胞系均顯示出細胞毒性，最佳IC50值為0.7 μmol/L；之后又從紅樹Rhizophora apiculata根部的內生真菌Aspergillus candidusLDJ-5［5］中分離得到9 個新型化合物prenylterphenyllins F～J 和prenylcandidusins D～G，活性結果顯示，prenylterphenyllin H 具有較好的抗菌活性和抗腫瘤活性。中國科學院王斌貴課題組利用乙醇脅迫紅樹林內生真菌Aspergillus nidulansMA-143［6］代謝產生了1 種新型的抗菌蒽醌衍生物isoversicolorin C，隨后又從深海冷泉真菌Aspergillus insuetusSD-512［7］中獲得3 個新型蛇孢菌素二倍半萜和3 個新型法尼基化苯酞衍生物，活性結果表明化合物具有廣泛的抑菌活性。佘志剛課題組［8-9］先后從海南紅樹林內生真菌Aspergillussp.16-5c中獲得1個罕見的5/7/（3）6/5五環二倍半萜asperterpenoid A和2個新型二聚萘酮asperlones A-B，化合物均顯示有顯著的MptpB 酶抑制活性，IC50分別為2.2、4.24和4.32 μmol/L。綜上，紅樹林共生的曲霉活性次級代謝產物具有非常廣泛的研究前景，值得深入挖掘。

本課題組對來源于北海金海灣紅樹林保護區紅樹秋茄葉片的內生真菌Aspergillussp. GXIMD00016 進行大規模發酵培養，對其發酵產物進行了分離純化并獲得了7個化合物，利用核磁共振技術和質譜技術最終確定了化合物的結構，包括3個苯醌衍生物（aculeatusquinone A（1）、aculeatusquinone C（2）、roseopurpurin A（3））、2 個呫噸酮衍生物（myxotrichin C（4）和2，7-didechlorovicanic（5））以及2個苯二醇衍生物（atraric acid（6）和2，5-dimethyl-1，3-benzenediol（7））（圖1）；其中2，7-didechlorovicanic（5）首次從天然產物中分離得到，化合物3 和4為首次從曲霉菌屬中獲得。通過查閱文獻發現，myxotrichin C（4）［10］具有較強的抗炎活性和PTP1B（protein tyrosine phosphatase 1B）抑制活性。隨后，課題組通過LPS 誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7 建立模型評價了另外6個化合物的抗炎活性，活性結果顯示，化合物1～3具有顯著的抗炎作用，IC50分別 為（16.68 ± 0.41）、（28.15 ± 0.62）和（22.34 ±0.63）μmol/L，優于陽性對照物地塞米松。

圖1 化合物1～7的結構Fig.1 The structure of compounds 1-7

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

EYELA 旋轉蒸發儀N-1300S（日本東京理化器械株式會社）；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌器（日本Panasonic 公司）；Polaptronic HNQW5 型旋光儀（德國Schmidt-Haensch 公司）；Bruker 600 MHz 核磁儀（瑞士Bruker 公司）；Thermo Finnigan LCQDECA 質譜儀（美國Thermo 公司）；島津LC-20AP 制備型HPLC（日本SHIMADZU 公司）；SWCJ-2F 醫用型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；ZWYR-2102立式恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；AL104 萬分之一電子天平（瑞士士METTLER TOLEDO公司）；Epoch 全波長酶標儀（美國BioTek公司）；YMC ODS-A色譜柱（日本YMC 公司）；青島海洋化工薄層層析板GF254 和柱層析硅膠（200～300 目）；核磁測試用氘代試劑、MTT 細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒、LPS（美國Sigma-Aldrich 公司）；NO 檢測試劑盒（S0021S）（碧云天生物技術研究所）；HPLC 用甲醇為色譜純，柱層析用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇為分析純。

1.2 菌株來源

內生真菌Aspergillussp. GXIMD00016 采集自北海金海灣紅樹林保護區，從紅樹植物秋茄Kandelia candel的葉子中分離純化得到。通過用真菌ITS間隔序列的堿基序列在GenBank做對比相似性分析，與菌株Aspergillussp.（KJ567455.1）有99%的相似度，因此鑒定菌株GXIMD00016 為Aspergillussp.。該菌株現保藏于廣西中醫藥大學海洋藥物研究院（菌株編號GXIMD00016）。

1.3 發酵條件

種子培養基（PDB）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、海鹽3 g、水1 000 mL；發酵培養基：東北大米50 g，w=3‰海鹽水50 mL。將純化的菌種接到裝有200 mL 土豆培養液的錐形瓶（500 mL）中，在28 ℃搖床培養3～5 d，獲得種子培養液；取2 mL種子培養液加到裝有大米培養基的錐形瓶（1 000 mL）中，接種100瓶，28 ℃靜置培養28 d。

1.4 提取與分離

用3 倍體積甲醇浸泡菌體3 次，每次24 h，減壓濃縮得粗提液，用等體積乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮除去乙酸乙酯獲得粗浸膏（40 g），采用硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯為流動相進行梯度洗脫［V石油醚∶V乙酸乙酯= 1∶9～0∶10］，獲得6 個組分（Fr. 1～ 6）。其中Fr. 3（3.2 g）經正相柱層析［V二氯甲烷∶V甲醇= 10∶0～1∶9］、凝膠Sephadex LH-20［V氯仿∶V甲醇= 1∶1］以及半制備HPLC［V乙腈∶V水= 40∶60］純化獲得化合物1（7.1 mg，tR21.5 min）、2（9.2 mg，tR11.5 min）、3（10.5 mg，tR9.5 min）和4（11.4 mg，tR18.3 min）；Fr.4（3.5 g）經凝膠Sephadex LH-20（甲醇）和半制備HPLC［V乙腈∶V水=50∶50］純化得到化合物5（9.4 mg，tR12.3 min）、6（10.6 mg，tR7.2 min）和7（7.4 mg，tR5.2 min）。

1.5 抗炎活性實驗

1.5.1 化合物對NO生成量的抑制作用 參考獻［11］中活性檢測方法，實驗設陰性對照組（不含樣品和LPS）、陽性對照組（含LPS）、陽性藥物組（含地塞米松）和實驗組（含藥物和LPS），每組數據平行測試3次。取100μL對數生長期的小鼠巨噬細胞RAW 264.7 接種于96 孔板上，每孔1×105個。隨后靜置于培養箱中孵育24 h，吸盡上清液，加入100 μL 含不同質量濃度梯度藥物的培養基，再加入LPS 溶液（終質量濃度1 μg/mL）。細胞繼續孵育24 h。按一氧化氮檢測試劑盒的方法取上清液進行反應，測定540 nm處的吸光度。

1.5.2 化合物的細胞毒活性參考文獻［11］中細胞毒活性方法，實驗設陰性對照組（不含樣品和LPS）、陽性對照組（含LPS）、陽性藥物組（含地塞米松）和實驗組（含藥物和LPS），每組數據平行測試3 次。取100 μL 對數生長期的小鼠巨噬細胞RAW264.7 細胞接種于96 孔板上，每孔1×105個。隨后靜置于培養箱中孵育24 h，吸盡上清液，加入100 μL 含不同質量濃度梯度藥物的培養基，靜置于培養箱中培養24 h 后，隨后每孔加入50μL 質量濃度為1 mg/mL 的MTT 溶液，繼續培養4 h 后，吸盡上清液，最后每孔中加入100μL DMSO，測定490 nm處的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 結構鑒定

化合物1：紅色粉末，EI-MSm/z288［M］+，結合核磁數據推測分子式為C16H16O5，不飽和度為9。核 磁 數 據 如 下：1H NMR（methanol-d4，600 MHz）δH1.86（3H，s，H-7），1.79（3H，s，H-8），6.30（1H，s，H-4′），5.90（1H，s，H-6′），2.08（3H，s，H-7′），2.09（3H，s，H-8′）；13C NMR（methanol-d4，150 MHz）δC182.4（C-1），152.1（C-2），128.6（C-3），184.1（C-4），154.1（C-5），115.0（C-6），9.1（C-7），8.2（C-8），156.7（C-1′），109.9（C-2′），156.7（C-3′），110.9（C-4′），136.0（C-5′），106.4（C-6′），8.9（C-7′），21.3（C-8′）。與文獻［12］數據比對，化合物1鑒定為aculeatusquinone A。

1H NMR（methanol-d4，600 MHz）δH5.01（1H，s，H-2），4.61（1H，s，H-4），1.20（3H，s，H-7），1.69（3H，s，H-8），6.26（1H，s，H-4′），6.23（1H，s，H-6′），2.06（3H，s，H-7′），2.14（3H，s，H-8′），3.16（3H，s，3-OMe）；13C NMR（methanol-d4，150 MHz）δC82.1（C-2），84.5（C-3），72.2（C-4），109.1（C-6），13.1（C-7），7.8（C-8），159.6（C-1′），110.9（C-2′），156.8（C-3′），110.2（C-4′），137.0（C-5′），107.2（C-6′），8.7（C-7′），21.6（C-8′），51.1（3-OMe）。與文獻［13］數據比對，化合物2鑒定為aculeatusquinone C。

化合物4：黃色粉末，EI-MSm/z246［M］+，結合核磁數據推測其的分子式為C13H10O5，不飽和度為9。核 磁 數 據 如 下：1H NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH1.97（3H，s，H-1），5.64（1H，s，H-3），5.12（2H，s，H-6），6.77（1H，s，H-10），7.22（1H，s，H-13）；13C NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC19.8（C-1），166.2（C-2），94.9（C-3），158.1（C-4），101.0（C-5），64.2（C-6），171.8（C-7），116.0（C-8），152.4（C-9），102.8（C-10），149.9（C-11），144.5（C-12），107.5（C-13）。與文獻［14］數據比對，鑒定化合物4 為myxotrichin C。

化合物5：白色粉末，EI-MSm/z314［M］+，結合核磁數據推測其分子式為C18H18O5，不飽和度為10。核磁數據如下：1H NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH6.47（1H，s，H-2），6.59（1H，s，H-7），2.28（3H，s，1-CH3），2.04（3H，s，4-CH3），2.28（3H，s，6-CH3），3.16（3H，s，8-OCH3），2.20（3H，s，9-CH3）；13C NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC141.4（C-1），111.9（C-2），160.4（C-3），113.0（C-4），161.3（C-4a），142.5（C-5a），126.8（C-6），112.9（C-7），152.7（C-8），113.9（C-9），143.5（C-9a），163.6（C-11），114.6（C-11a），20.9（1-CH3），9.4（4-CH3），17.2（6-CH3），48.9（8-OCH3），9.8（9-CH3）。以上數據與文獻［15］報道的半合成化合物2，7-didechlorovicanic結構一致，化合物5為新的天然產物。

化合物6：黃色針晶，EI-MSm/z196［M］+，結合核磁數據推測其分子式為C10H12O4，不飽和度為5。核磁數據如下：1H NMR（methanol-d4，600 MHz）δH6.18（1H，s，H-5），2.39（3H，s，H-8），1.97（3H，s，H-9），3.86（3H，s，H-10）；13C NMR（methanol-d4，150 MHz）δC104.9（C-1），164.2（C-2），109.9（C-3），161.5（C-4），111.5（C-5），140.9（C-6），174.0（C-7），7.9（C-8），24.3（C-9），52.0（C-10）。與文獻［16］數據比對，鑒定化合物6為atraric acid。

化合物7：白色粉末，EI-MSm/z138［M］+，結合核磁數據推測分子式為C8H10O2，不飽和度為4。核磁數據如下：1H NMR（MeOH-d4，600 MHz）δH6.09（2H，s，H-4/6），2.10（3H，s，H-7），1.94（3H，s，H-8）；13C NMR（MeOH-d4，150 MHz）δC157.1（C-1/3），108.3（C-2），108.9（C-4/6），136.8（C-5），8.2（C-7），21.3（C-8）。與文獻［12］數據比對，鑒定化合物7為2，5-dimethyl-1，3-benzenediol。

2.2 抗炎活性結果

以地塞米松作為本實驗的陽性對照，對化合物1～3 和5～7 的抗炎活性進行了評價，考察其對LPS 誘導巨噬細胞RAW 264.7 產生NO 的抑制作用，結果表明化合物1～3 具有顯著的抑制作用，IC50分 別 為（16.68 ± 0.41）、（28.15 ± 0.62）和（22.34 ± 0.63）μmol/L，優于地塞米松［IC50（36.08± 1.24）μmol/L］；化合物5～7 活性差或無活性（活性數據詳見表1）。同時，利用MTT 法檢測化合物的RAW 264.7 細胞毒性，結果表明，當化合物濃度大于100 μmol/L時均未表現出細胞毒性。

表1 化合物對LPS誘導RAW 264.7產生NO的抑制活性Table 1 Inhibitory activity of compounds against LPS induced NO production in RAW 264.7 cells（n=3，xˉ±s）

3 結 語

本文從北海金海灣紅樹植物秋茄葉片的內生真菌Aspergillussp. GXIMD00016 中分離得到7 個化合物，分別是aculeatusquinone A（1）、aculeatusquinone C（2）、roseopurpurin A（3）、myxotrichin C（4）、2，7-didechlorovicanic（5）、atraric acid（6）和2，5-dimethyl-1，3-benzenediol（7），其中，化合物5 為新天然產物，化合物3 和4 為首次從曲霉菌屬中獲得。首次發現苯醌衍生物1～3 具有顯著的體外抗炎活性，且活性優于地塞米松，具有開發為抗炎藥的潛力。