酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽工藝

張國玉，俞存兵，余奕珂，李宣延

遼漁集團有限公司（大連 116113）

我國是一個漁業大國，漁業資源極為豐富。近些年隨著我國遠洋漁業的快速發展，魷魚產量逐年增加，魷魚在加工過程中，產生大量魷魚皮和魷魚內臟的廢棄物。只有少量工廠將其加工為低值水產飼料，大部分工廠均采用掩埋丟棄等方法[1]，造成資源的極大浪費。實際上，魷魚皮中含有大量蛋白質，其中含量最多的是膠原蛋白，因此魷魚皮可作為一種新型的膠原蛋白資源[2]。

現代科學研究證實，海洋生物蛋白質經水解后得到的海洋生物活性肽有增強免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等活性[3]，在醫藥、保健品和化妝品等高附加值領域得到應用[4-5]。此外，海洋動物蛋白在酶解、低抗原性、低過敏性等方面要優于陸地動物蛋白[6-8]。許慶齡等[9]開展熱水提取法、酶解提取法等制備魷魚皮膠原蛋白的工藝研究。林燕等[10]研究發現利用魷魚皮提取的膠原蛋白肽具有良好的生產加工性能，其抗氧化性、溶解性、泡沫穩定性等較為穩定，在食品、功能食品和化妝品領域應用前景廣泛。試驗以秘魯魷魚（Dosidicus gigas）加工廢棄物魷魚皮為原料，選取一種合適酶，優化酶解條件，并確立魷魚皮膠原蛋白肽制備工藝，為魷魚皮的高附加值利用提供理論依據，對于魷魚資源的綜合利用有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秘魯魷魚皮（遼漁集團魚品加工廠）；胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、alcalase蛋白酶（大連聯合博泰生物技術有限公司）；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

LX-B50型立式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）；GL-21M高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；UV759CRT紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；FD-1B-50型冷凍干燥機（北京博醫康實驗室儀器有限公司）。

1.3 工藝流程

秘魯魷魚皮→原料預處理→熱水提取膠原蛋白→酶解→滅酶→離心分離→真空濃縮→冷凍干燥→膠原蛋白肽粉

1.4 試驗方法

取一定量的秘魯魷魚皮，解凍后清洗，將魷魚皮剪成小塊后，分別用一定濃度的NaOH溶液和硫酸溶液浸泡，水洗至中性，勻漿后熱水提取膠原蛋白，調節膠原蛋白溶液pH，加入一定量的酶，恒溫酶解，水解結束后滅酶離心得到酶解液，酶解液經真空濃縮凍干得到膠原蛋白肽粉。

1.5 測定指標及分析方法

水分：按GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》測定；灰分：按GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》測定；總蛋白：按GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》測定；總脂：按GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》測定；總糖：按GB/T 9695.31—2018《肉制品 總糖含量的測定》測定；羥脯氨酸：按GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》測定。

肽及氨基酸：稱取樣品，加入三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置10 min，離心取上清液，按GB/T 5009.5測定總蛋白含量。

2 結果與討論

2.1 水解用酶的確定

選擇胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、alcalase蛋白酶為水解酶，分別在最適條件下酶解，以肽及氨基酸含量和得率作為評價指標，結果見表1。胃蛋白酶水解后肽及氨基酸含量和得率均較低，木瓜蛋白酶和alcalase蛋白酶水解后得率偏低，而中性蛋白酶和胰蛋白酶水解后肽及氨基酸含量和得率均較高，考慮到酶價格及能耗因素，選擇中性蛋白酶作為水解用酶。

表1 各種酶水解效果的比較

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對酶解效果的影響

魷魚皮經前處理后，分別按料液比1∶2，1∶4，1∶6，1∶8和1∶10（kg/L）提取膠原蛋白，提取后酶解得到膠原蛋白肽粉，以得率為評價指標，結果見圖1。隨著液體占比增加，中性蛋白酶酶解作用充分，得率隨之升高，但液體占比過大時，酶濃度降低，導致得率下降，料液比1∶6（kg/L）時得率最高，因此選取1∶6（kg/L）為最佳料液比。

圖1 不同料液比對得率的影響

2.2.2 不同加酶量對酶解效果的影響

魷魚皮經前處理后，按料液比1∶6（kg/L）加水提取膠原蛋白，加酶量分別為600，1 200，1 800，2 400和3 000 U/g，酶解后得到膠原蛋白肽粉，以得率為評價指標，結果見圖2。隨著加酶量增加，酶濃度增加，得率也隨之提高，但得率相差不大，考慮到成本因素，加酶量選擇600 U/g。

圖2 不同加酶量對得率的影響

2.2.3 不同酶解時間對酶解效果的影響

魷魚皮經前處理后，按料液比1∶6（kg/L）提取膠原蛋白，酶解時間分別為2，3，4，6，8，16和24 h，以得率為評價指標，結果見圖3。隨著酶解時間延長，得率逐漸提高，后期趨向平穩，雖然總體結果差異較小，但酶解時間短會導致得到的肽粉中肽段多屬于大分子肽鏈，不利于人體吸收，因此酶解時間選擇6 h。

圖3 不同酶解時間對得率的影響

2.3 正交試驗

將料液比固定為1∶6（kg/L），選取加酶量、溫度、pH和時間4個因素，以得率和肽及氨基酸含量為評價指標，進行四因素三水平正交試驗，見表2。

表2 正交試驗因素與水平表

正交試驗結果見表3。肽及氨基酸含量結果差異較小，因此選擇得率作為正交試驗評價指標，極差分析顯示，各因素對得率影響結果為D＞B＞A＞C，最佳酶解工藝為A2B1C1D2，即加酶量600 U/g、溫度45℃、pH 6.0、酶解時間4 h。

表3 正交試驗結果表

2.4 膠原蛋白肽粉營養成分分析

將秘魯魷魚皮經前處理后，按優化后確定的酶解工藝得到膠原蛋白肽粉。其感官評價和營養成分分析結果分別見表4和表5。

由表4可知，該肽粉呈淡黃色粉末狀，具有該產品特有的氣味，無其他異味，符合膠原蛋白肽粉的行業標準要求。由表5可知，該肽粉高蛋白且低脂低糖，營養價值較高，肽粉中的羥脯氨酸含量較高，說明肽粉總蛋白中膠原蛋白肽比例較高，達到膠原蛋白肽粉的行業標準要求。

表4 魷魚皮膠原蛋白肽粉感官指標

表5 魷魚皮膠原蛋白肽粉營養成分 單位：%

3 結論

從5種蛋白酶中篩選中性蛋白酶作為魷魚皮水解用酶，通過單因素試驗確定熱水提取膠原蛋白的料液比，通過正交試驗進一步優化酶解條件，最終確定酶解條件：加酶量600 U/g、溫度45 ℃、pH 6.0、酶解時間4 h。在此酶解工藝條件下得到的肽粉呈淡黃色粉末狀，是一種低脂、低糖、高蛋白的肽粉，營養價值較高，初步達到膠原蛋白肽粉的行業標準要求。

在此酶解工藝下得到的魷魚皮膠原蛋白肽粉雖蛋白含量較高，但其中肽段分子量大小不均一，且灰分較高，因此在后續工藝優化中考慮將魷魚皮膠原蛋白肽酶解液過不同分子量的超濾膜，從而實現不同分子量的膠原蛋白肽段的梯級分離，同時可降低灰分比重，得到功效更好的產品。