梧桐子生物堿的提取及抗氧化、抑菌活性研究

王萍，位治國，郭金英，任國艷，吳影，喻磊

1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院（洛陽 471023）；2.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院（洛陽 471023）

梧桐子為落葉喬木梧桐（Firmiana plantanifoliaMarsili）的干燥成熟種子，在我國主要產(chǎn)于江蘇、浙江、甘肅、河南、安徽等地，其味甘性平、無毒，富含脂肪、灰分、粗纖維、蛋白質(zhì)、非氮物質(zhì)、咖啡堿等成分。目前對梧桐子的研究主要是梧桐子總黃酮及蛋白質(zhì)的提取工藝[1-2]，梧桐子油的提取、成分分析及梧桐子油脂肪酸制備[3-4]，梧桐子油對脂肪酸組成、含量及脂代謝的影響[5-6]等方面，而梧桐子生物堿的提取及其抗氧化抑菌活性還未見報道。

生物堿是廣泛存在于植物中的一類有機(jī)含氮化合物，是次級代謝物之一，大多味苦，對生物機(jī)體有毒性或強(qiáng)烈的生理作用。研究表明，生物堿具有抗癌、抗炎、緩解疼痛、減肥、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗真菌等多種功效[7-8]。生物堿的提取方法主要有微波、超聲和壓力輔助的醇溶劑提取法、酸水及熱水萃取法等[9-11]，超聲波技術(shù)利用超聲波與介質(zhì)的機(jī)械摩擦、空化、解聚、放熱等作用，使天然產(chǎn)物在溶劑中瞬間產(chǎn)生的空穴崩解，細(xì)胞破碎，從而縮短了胞內(nèi)外的物質(zhì)交換時間[12]。

試驗通過超聲輔助醇提法優(yōu)化梧桐子生物堿的提取工藝，并采用體外抗氧化和抑菌試驗評價其抗氧化和抑菌活性，為梧桐子的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

梧桐子，購自安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司（河北保定）；受試菌種，由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供。

鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；無水乙醇、鐵氰化鉀{K3[Fe(CN)6]}、三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）、溴百里香酚藍(lán)、DPPH、ABTS、過硫酸鉀、抗壞血酸等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CLF-30B高速連續(xù)型超微粉碎機(jī)（浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州市亞榮儀器有限公司）；EPPENDORF移液槍（北京精密儀器有限公司）；MAPADA紫外-可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理

將梧桐子處理干凈，粉碎，過0.180 mm篩后收集保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取5.00 mg鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)樣，加無水乙醇溶解并定容至5 mL的棕色容量瓶中，得黃色儲備液。分別量取0，5，10，15，20，40，60和80 μL標(biāo)準(zhǔn)樣儲備液于量瓶中，加入5 mL溴百里香酚藍(lán)溶液，充分反應(yīng)后，加入5 mL三氯甲烷溶液，劇烈振蕩5 min，靜置30 min，取下層萃取液。以三氯甲烷為對照，在418 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制梧桐子生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.007 9x+0.013 2，R2=0.998 6。

1.2.3 單因素試驗

以料液比1∶15 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間30 min、提取溫度50 ℃為固定值，分別檢測乙醇體積分?jǐn)?shù)（55%，65%，75%，85%和95%）、提取時間（50，60，70，80和90 min）、料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25 g/mL）、提取溫度（20，30，40，50和60 ℃）對梧桐子生物堿提取率的影響。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比、提取溫度為試驗因素，以生物堿提取率為評價指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平正交試驗優(yōu)化梧桐子生物堿提取工藝條件。

1.2.5 梧桐子生物堿提取

稱取5 g梧桐子粉，按相應(yīng)的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比、提取溫度對生物堿進(jìn)行超聲提取，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液。取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，于-80 ℃冷凍并真空冷凍干燥得到總生物堿提取物固態(tài)粉末，儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2.6 體外抗氧化活性

1) DPPH自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[13]并稍有改動。以含有5% DMSO的乙醇溶液配制0.1 mmol/L DPPH自由基溶液（此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）。取2 mL不同濃度梧桐子生物堿提取液，加入2 mL DPPH自由基溶液，混勻，室溫避光孵育30 min，測定517 nm處吸光度。以VC為對照，每組重復(fù)3次，取平均值。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：D為自由基清除率，%；A為樣品吸光度；A0為反應(yīng)體系吸光度。

2) ABTS自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[14]并稍有改動。精確稱取3 mg ABTS，加入0.735 mL蒸餾水，配制7.4 mg/L的ABTS儲備液。取1 g過硫酸鉀于1.43 mL蒸餾水中溶解，配制2.6 mmol/mL的過硫酸鉀儲備液。ABTS儲備液與過硫酸鉀儲備液按體積比1∶1混勻，室溫避光反應(yīng)12 h，制成ABTS母液。用無水乙醇將ABTS母液進(jìn)行30～40倍稀釋，測定734 nm處吸光度。取不同濃度提取液各0.1 mL，加入3.9 mL稀釋好的ABTS工作液，搖勻，室溫避光反應(yīng)15 min，測定734 nm處吸光度。以VC為對照，每組重復(fù)3次，取平均值。按公式（1）計算ABTS自由基清除率。

3) 總還原能力：參照文獻(xiàn)[15]并稍有改動。取1 mL不同濃度梧桐子生物堿提取液，分別加入0.2 mol/L PBS（pH 6.6）和1% K3[Fe(CN)6]，各2.5 mL，在50 ℃下反應(yīng)20 min，再加入10% TCA 2.5 mL，以4 000 r/min離心15 min，取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%氯化鐵，混勻，10 min后在700 nm處測定吸光度，以VC為對照，每組重復(fù)3次，取平均值，增加的吸光度表示還原能力的增加。

1.2.7 抑菌活性試驗

將受試菌接種在培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，然后用接種環(huán)挑取活化后的菌種于滅菌的蒸餾水中，混合均勻制成菌懸液。抑菌試驗采用濾紙片法[16]：將滅菌的直徑6 mm的圓形濾紙片烘干后，浸泡于制備好的梧桐子生物堿提取液中12 h，晾干；將制備好的菌懸液（200 μL）均勻涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基表面，然后用無菌鑷子將晾干的濾紙片貼在培養(yǎng)基的表面，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測定抑菌圈直徑，并用無菌蒸餾水作空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對梧桐子生物堿提取率的影響

固定料液比1∶15 g/mL、提取時間60 min、提取溫度50 ℃，檢測不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（55%，65%，75%，85%和95%）對梧桐子生物堿提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，梧桐子生物堿提取率先升高后下降。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時，梧桐子生物堿提取率最高，達(dá)到1.78 μg/mg，這可能與梧桐子生物堿的極性有關(guān)，65%乙醇中梧桐子生物堿的溶解度最大[17-18]。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對梧桐子生物堿提取率的影響

2.1.2 提取時間對梧桐子生物堿提取率的影響

固定料液比1∶15 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取溫度50 ℃，檢測不同提取時間（50，60，70，80和90 min）對梧桐子生物堿提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著提取時間的延長，梧桐子生物堿提取率先升高后下降。在提取時間為80 min時，梧桐子生物堿提取率最高，達(dá)到2.58 μg/mg，而后提取率的下降，可能是生物堿遭到破壞所致[19]。

圖2 提取時間對梧桐子生物堿提取率的影響

2.1.3 提取溫度對梧桐子生物堿提取率的影響

固定料液比1∶15 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間60 min，檢測不同提取溫度（20，30，40，50和60 ℃）對梧桐子生物堿提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著提取溫度的增加，梧桐子生物堿提取率先升高后下降。在提取溫度為50 ℃時，梧桐子生物堿提取率最高，達(dá)到3.98 μg/mg。而后提取率的下降，可能是生物堿分解所致[20]。

圖3 提取溫度對梧桐子生物堿提取率的影響

2.1.4 料液比對梧桐子生物堿提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間60 min、提取溫度50 ℃，檢測不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25 g/mL）對梧桐子生物堿提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著料液比的增加，梧桐子生物堿提取率先升高后下降。在料液比為1∶15 g/mL時，梧桐子生物堿提取率最高，達(dá)到3.83 μg/mg，這可能與梧桐子生物堿的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有關(guān)。

圖4 料液比對梧桐子生物堿提取率的影響

2.2 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇合理的因素和水平（表1），通過L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗，結(jié)果如表2所示。

表1 正交試驗因素和水平

表2 L9(34)試驗設(shè)計方案及結(jié)果

由正交試驗極差分析可知，各因素影響梧桐子生物堿提取率的主次順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間=料液比＞提取溫度，即乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響梧桐子生物堿提取率的最顯著因素。梧桐子生物堿提取的最佳參數(shù)組合是A1B3C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間90 min、提取溫度40 ℃、料液比1∶20 g/mL。由于該組合不在正交試驗組合中，需對此最優(yōu)組合進(jìn)行驗證，重復(fù)3次，結(jié)果表明生物堿的提取率高于正交試驗的所有組合并且比較穩(wěn)定，為4.02 μg/mg。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

梧桐子生物堿對DPPH自由基的清除能力見圖5。梧桐子總生物堿提取物在質(zhì)量濃度0.2～0.4 mg/mL區(qū)間時，隨著提取物濃度的增加，其對DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度0.4 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除能力為20.4%，且趨于穩(wěn)定。

圖5 梧桐子生物堿對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 ABTS自由基清除能力

梧桐子生物堿對ABTS自由基的清除能力見圖6。梧桐子總生物堿提取物在濃度質(zhì)量0.2～0.8 mg/mL區(qū)間時，隨著濃度的增加，其對ABTS自由基的清除能力顯著增強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL時，其對ABTS自由基的清除能力趨于穩(wěn)定。

圖6 梧桐子生物堿對DPPH自由基的清除能力

2.3.3 總還原能力

由圖7可知，梧桐子生物堿提取物的總還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)緩慢增強(qiáng)的趨勢，在質(zhì)量濃度達(dá)到0.16 mg/mL時，趨于穩(wěn)定。

圖7 梧桐子生物堿的總還原能力

2.4 抑菌活性

采用濾紙片擴(kuò)散法，測定梧桐子生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結(jié)果見表3。不同濃度的梧桐子生物堿溶液對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌均有一定的抑制作用，并且同一質(zhì)量濃度下，其對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯優(yōu)于大腸桿菌。試驗結(jié)果表明，梧桐子生物堿具有一定的抑菌效果，且抑菌效果高于同濃度下的菊葉香藜總生物堿的抑菌效果[21]。

表3 梧桐子生物堿抑菌試驗結(jié)果

3 結(jié)論

試驗使用超聲波輔助熱水法提取梧桐子總生物堿，首先通過單因素試驗得到各個因素的最佳范圍條件，再使用正交法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，找到影響梧桐子生物堿提取的主次因素及各因素的最優(yōu)組合。結(jié)果表明，梧桐子生物堿的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間90 min、提取溫度40℃、料液比1∶20 g/mL，此條件下梧桐子生物堿的提取率為4.02 μg/mg。體外抗氧化試驗發(fā)現(xiàn)，梧桐子生物堿對DPPH自由基、ABTS自由基均具有一定的清除能力，且和總還原能力一樣呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。抑菌試驗結(jié)果表明梧桐子生物堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均有一定的抑制效果，且對金黃色葡萄球菌抑制作用更為明顯。體外抗氧化和抑菌試驗表明梧桐子生物堿有可能成為一種新的天然抗氧化劑和抑菌劑原料去替代合成抗氧化劑和抗生素應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境等領(lǐng)域，擴(kuò)大了梧桐子資源的利用范圍。