液相色譜質(zhì)聯(lián)法測定火鍋底料中合成辣椒素

董葉箐，劉強欣，楊明，孫文閃*，鄭劍峰，鐘寒輝

1.綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司（杭州 310000）；2.杭州郝姆斯食品有限公司（杭州 310000）

火鍋作為一種便捷的美食，在我國川渝餐飲文化中占有重要地位。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，各地區(qū)之間餐飲文化的交匯，火鍋這一便捷的美食受到越來越多消費者的喜愛。而火鍋產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展離不開火鍋底料。而辣椒作為火鍋底料的重要原材料之一，辣椒里的辣椒素類物質(zhì)賦予了火鍋底料90%以上的辣感[1-2]。辣椒堿是一類N-香草基酰胺類生物堿的物質(zhì)，其中天然辣椒素和二氫辣椒素占總辣椒堿的90%以上[3-4]。合成辣椒素是人工合成的具有類似于天然辣椒素生物功能的物質(zhì)，由于其價格與辣度的絕對優(yōu)勢受到不法商販的青睞，進而在火鍋底料里添加合成辣椒素來替代天然辣椒素和二氫辣椒素滿足消費者對辣感的需求。因此建立一種簡單快速準確的測定火鍋底料中合成辣椒素的檢測方法對保障人們舌尖上的安全具有重要意義。

目前，辣椒素的檢測方法有分光光度法[5]、液相色譜法[6-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-17]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-19]。分光光度法檢測結(jié)果為辣椒素含量的總和，不能對單一組分的含量進行定量檢測，且靈敏度低；液相色譜法的方法檢出限較高，通過保留時間進行定性，容易產(chǎn)生假陽性；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法前處理需要對辣椒素進行衍生化，反應(yīng)不穩(wěn)定且操作麻煩，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、定性定量準確、分析速度快等優(yōu)點，適合于痕量級辣椒素的測定，當前主要應(yīng)用于油脂中辣椒素類物質(zhì)的檢測，對于火鍋底料這樣復(fù)雜基質(zhì)，目前未見到相關(guān)的報道，文章對樣品前處理和上機測定條件進行了優(yōu)化，建立了固相萃取凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中的合成辣椒素的方法，該方法簡單快速、靈敏度高、準確穩(wěn)定，并通過實際樣品的檢測驗證方法的可靠性，為市場監(jiān)管部門對火鍋底料的質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC30A超高液相色譜8050三重四極桿質(zhì)譜，配電噴霧離子源（日本島津公司）；DMT-2500多管渦旋混合儀（杭州瑞誠儀器有限公司）；ST16R高速冷凍離心機（賽默飛世爾公司）；Millipore超純水機（美國Millipore公司），BSA224S電子天平（德國賽多利斯公司）；Supelco固相萃取裝置（上海安普股份有限公司）。

正己烷、乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，美國Thermo公司）；試驗用水為一級水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。合成辣椒素（純度94.0%，美國CATO公司）。

樣品為市售火鍋底料。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

標準儲備液：精確稱取0.013 28 g的合成辣椒素用甲醇溶解定容到25 mL容量瓶中，得到500 mg/L標準儲備液，于-20 ℃避光保存。標準中間液：準確吸取1.00 mL儲備液，用甲醇稀釋定容至100 mL容量瓶，得到5.0 mg/L。標準曲線現(xiàn)配現(xiàn)用，用10%的乙腈水溶液稀釋配制0.025，0.05，1，5，10，20和50 μg/L標準工作液。

1.2.2 前處理方法

提取：稱取（1.000±0.005）g樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，渦旋1 min，超聲20 min，按8 000 r/min離心3 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，再加入5 mL正己烷，渦旋30 s，按8 000 r/min離心3 min，棄去上層正己烷，下層提取液加入1 mL 4 mol/L硫酸溶液混勻，待凈化。

凈化：將全部提取液過PLS小柱（預(yù)先5 mL乙腈、5 mL水活化）棄去不要，加入5 mL乙腈-水（20∶80，V/V）淋洗，棄去淋洗液，抽干小柱，加入5 mL乙腈洗脫，收集全部洗脫液至10 mL刻度管，于40 ℃氮吹至近干，準確加入1.0 mL 0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈（90∶10，V/V）渦旋30 s，超聲30 s復(fù)溶，過0.22 μm PTFE濾膜，待上機檢測。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：安捷倫InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（3 mm×150 mm，2.7 μm）；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流動相為0.2%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；流速為0.25 mL/min；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度程序

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子掃描模式，Heat Block溫度：400 ℃，毛細管電壓：3 000 V；霧化氣流量：3.0 L/min；加熱氣流量：10.0 L/min；DL管溫度230 ℃，Interface溫度280 ℃。定量與定性離子對的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 合成辣椒素的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

辣椒素類化合物結(jié)構(gòu)中存在酰胺基團，在電噴霧正離子模式下易得到質(zhì)子，從而形成[M+H]+準分子離子峰。將1 mg/L合成辣椒素標準溶液在質(zhì)荷比m/z100.0～400.0范圍進行一級掃描，找到其母離子m/z294.2，然后再對母離子進行二級質(zhì)譜掃描（子離子掃描），確定相應(yīng)的兩個子離子分別為m/z137.0和m/z170.2，對母離子和子離子進行Q1偏轉(zhuǎn)電壓，碰撞能量和Q3偏轉(zhuǎn)電壓優(yōu)化，使得兩離子對響應(yīng)達到最佳值，優(yōu)化的結(jié)果見表2。

2.2 液相條件的優(yōu)化

合成辣椒素的結(jié)構(gòu)中包含苯環(huán)和直鏈碳官能團，因此極性較弱，適合采用C18柱進行分離，比較了安捷倫InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（3 mm×150 mm，2.7 μm），月旭Ultimate AQ-C18（2.1 mm×100 mm×1.8 μm），菲羅門 Kinetex C18（3 mm×150 mm，2.7 μm）對其分離保留效果，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，采用安捷倫InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱分析，其峰型和響應(yīng)較好，因此選擇InfinityLab Poroshell 120 ECC18進行分離。

圖1 不同色譜柱上合成辣椒素的MRM掃描色譜圖

同時，流動相也會對目標物的響應(yīng)產(chǎn)生一定的影響，研究比較了乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水三種流動相采用梯度洗脫對合成辣椒素質(zhì)譜信號的影響，結(jié)果見圖2。采用乙腈-0.2%甲酸水作為流動相時合成辣椒素的響應(yīng)最好。

圖2 不同流動相上合成辣椒素的MRM掃描色譜圖

因此，研究采用InfinityLab Poroshell 120 EC-C18為分離柱，乙腈-0.2%甲酸水為流動相進行梯度洗脫，洗脫程序見表1。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取劑的選擇

辣椒素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中包含苯環(huán)、直鏈碳等官能團，呈現(xiàn)一定的非極性，因此可以用甲醇、乙腈、乙醇等有機試劑來提取，而苯環(huán)上連接一個羥基，采用堿性溶液可以使其解離，增加在水溶液中的溶解性，同樣可以采用氫氧化鈉溶液進行提取。考慮到火鍋底料基質(zhì)的復(fù)雜性，含有油脂、蛋白質(zhì)、色素、調(diào)味劑等，采用氫氧化鈉溶液作為提取液，雜質(zhì)會更少，并且方便后續(xù)過柱凈化。試驗發(fā)現(xiàn)：采用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液進行提取，可以獲得滿意的回收率，因此試驗選擇0.5 mol/L氫氧化鈉溶液作為提取試劑。

2.3.2 提取方法的選擇

文章比較了超聲提取、振蕩提取兩種方法對合成辣椒素提取效果，以回收率做考察指標（加標質(zhì)量分數(shù)為100 μg/kg，n=6），兩種方法的提取效率見結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，超聲提取效果優(yōu)于振蕩提取，因此研究的提取方法選擇超聲。

圖3 兩種提取方法的提取效果比較（100 μg/kg，n=6）

2.3.3 提取試劑體積的優(yōu)化

提取劑和提取方法確定后，需要對提取劑體積進行優(yōu)化，這樣可以避免過多的試驗廢液的產(chǎn)生，降低試驗成本和廢液處理的成本。試驗比較了不同體積（5，10，15，20和25 mL）0.5 mol/L氫氧化鈉溶液超聲提取對回收率（加標質(zhì)量分數(shù)為100 μg/kg，n=6）的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，最佳的提取體積為15 mL，因此選擇提取劑體積為15 mL。

圖4 不同提取體積的提取效果

2.3.4 提取時間的優(yōu)化

在獲得滿意的提取回收率的前提下，盡量減少提取的時間，提高前處理效率，需要對提取時間進行優(yōu)化，當稱樣質(zhì)量為1 g，加入15 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，比較了不同超聲時間（5，10，15，20，25和30 min）對提取回收率（100 μg/kg，n=6）的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，最佳的提取時間為20 min。

圖5 不同時間的提取效果

2.3.5 凈化小柱的選擇

不同類型固相萃取小柱的凈化效果存在一定的差異，試驗比較了陰離子交換柱Oasis MAX（60 mg/3 mL）、親水親脂平衡凈化柱ProElut PLS（200 mg/6 mL）、C18固相萃取柱Cleanert S C18（1 g/6 mL）三種凈化柱對火鍋底料樣品凈化效果，基質(zhì)采用香辣型火鍋底料，加標質(zhì)量分數(shù)為100 μg/kg，三種凈化小柱回收率見圖6。從圖6可以看出，親水親脂平衡凈化柱ProElut PLS優(yōu)于C18固相萃取柱和陰離子交換柱。因此采用ProElut PLS作為凈化的固相萃取小柱。

圖6 不同小柱的凈化效果

2.3.6 淋洗液和洗脫液的優(yōu)化

為了獲得最佳的淋洗條件，研究以不同比例的乙腈-水（0∶100，10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50和60∶40，V/V）作為淋洗液進行淋洗，將濾液進樣分析。結(jié)果表明：當乙腈-水比例大于等于30∶70（V/V）時，濾液中有合成辣椒素檢出，其峰面積隨乙腈比例的升高而增大。為了有效去除火鍋底料中的雜質(zhì)，又能得到較好的回收率，研究采用乙腈-水（20∶80，V/V）作為淋洗液。

同時，對溶劑的洗脫體積進行了優(yōu)化，比較了不同體積（2，3，4，5，6和7 mL）的乙腈對目標物的洗脫效果，結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，當乙腈體積為5 mL時，合成辣椒素已完全洗脫，因此洗脫液的體積為5 mL。

圖7 不同體積乙腈洗脫效果

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限、定量限

將0.025，0.05，0.10，1.0，5.0，10.0和50.0 μg/L的系列合成辣椒素標準工作溶液進UPLC-MS/MS分析。以質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性擬合，得到標準工作曲線，線性方程為y=106 675x-24 501。其在0.025～50 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，合成辣椒素線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 5。空白樣品添加回收進樣測定，以3倍信噪比（rSN=3）對應(yīng)樣品濃度為檢出限，10倍信噪比（rSN=10）對應(yīng)樣品濃度為定量限，合成辣椒素的檢出限為0.02 μg/kg，定量限為0.05 μg/kg。

2.4.2 準確度與精密度

通過空白樣品加標回收試驗，考察本方法的準確度和精密度。按照已優(yōu)化的提取和凈化方法，選擇微辣、香辣、麻辣三種空白火鍋底料進行低、中、高三檔質(zhì)量分數(shù)（0.05，2.0和50 μg/kg）進行合成辣椒素的加標試驗，每個加標質(zhì)量分數(shù)做6個平行（見表3）。結(jié)果表明，在3個加標水平下，三種火鍋底料樣品中合成辣椒素的平均回收率為76.1%～94.2%，相對標準偏差為4.62%～9.11%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[20]規(guī)定的要求，可用于火鍋底料中合成辣椒素的定量檢測。

表3 回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品經(jīng)過提取后中除目標物以外的物質(zhì)在儀器分析測定時對目標物的干擾，進而對測定結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，液相色譜質(zhì)譜方法的建立需要評價基質(zhì)效應(yīng)。研究通過基質(zhì)標準溶液與溶劑標準溶液峰面積比值對基質(zhì)效應(yīng)進行評價。基質(zhì)效應(yīng)（ME）為基質(zhì)標準溶液峰面積與溶劑標準溶液峰面積比值乘以100%，當ME值在90%～110%之間時，標明無明顯基質(zhì)干擾，可以直接用溶劑標準曲線定量。文章對微辣、香辣、麻辣三種火鍋底料的基質(zhì)效應(yīng)進行了研究，三種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)見表4。從表4可以看出，微辣、香辣、麻辣三種火鍋底料低、中、高三檔濃度的基質(zhì)效應(yīng)在91.3～108之間，不存在明顯基質(zhì)效應(yīng)，因此可以用溶劑標準曲線直接定量。

表4 合成辣椒素在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

2.6 實際樣品檢測

按照研究建立的檢測方法對30批次火鍋底料進行檢測，部分火鍋底料中合成辣椒素有檢出，檢出限在11.1～253 μg/kg之間。

3 結(jié)論

試驗對前處理提取、凈化、儀器的色譜-質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化，選擇0.5 mol/L氫氧化鈉溶液進行提取，以ProElut-PLS作為凈化柱，對淋洗液、洗脫液進行了優(yōu)化，建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中合成辣椒素的方法。該方法前處理操作簡單，基質(zhì)干擾效應(yīng)低，靈敏度高，線性關(guān)系、準確度和精密度均能滿足方法學(xué)確認的要求，適用于火鍋底料中合成辣椒素的定性和定量檢測。