大鼠三叉神經(jīng)痛模型中小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況及經(jīng)時(shí)變化

盧妍竹 張婧琦 賴文莉

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正畸科，成都 610041

三叉神經(jīng)痛是在三叉神經(jīng)分布區(qū)域內(nèi)突然發(fā)作的、持續(xù)數(shù)秒至數(shù)分鐘的劇烈疼痛，其發(fā)作具有周期性、陣發(fā)性等特點(diǎn)，發(fā)作間歇無(wú)癥狀[1-2]。疼痛由三叉神經(jīng)末梢以神經(jīng)沖動(dòng)的形式傳遞至三叉神經(jīng)節(jié)，之后進(jìn)一步傳遞至延髓的三叉神經(jīng)核復(fù)合體，通過(guò)丘腦經(jīng)由眾多腦區(qū)調(diào)節(jié)后傳遞至大腦皮層而被感知[3]。疼痛發(fā)作時(shí)，傳入三叉神經(jīng)核的痛覺(jué)信息主要由三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核（spi‐nal trigeminal nucleus caudal part，Sp5C） 處 理[4]，該區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞可能出現(xiàn)激活。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有的重要免疫細(xì)胞，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，激活后形態(tài)發(fā)生明顯變化以獲得更強(qiáng)的吞噬及運(yùn)動(dòng)能力，且可以進(jìn)一步釋放促炎因子參與疼痛的發(fā)生和維持[5]。周圍神經(jīng)損傷引起的炎性反應(yīng)以及脊髓背角神經(jīng)元的過(guò)度興奮性，均為小膠質(zhì)細(xì)胞激活的促進(jìn)因素[6]。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在神經(jīng)病理性疼痛中起著關(guān)鍵作用，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[6]。

本研究的目的是通過(guò)經(jīng)口內(nèi)開(kāi)口結(jié)扎大鼠三叉神經(jīng)的眶下神經(jīng)（infraorbital nerve，IoN）分支，引起三叉神經(jīng)慢性壓迫性損傷（chronic con‐striction injury，CCI），構(gòu)建大鼠三叉神經(jīng)痛動(dòng)物模型（IoN-CCI）后，探索Sp5C中小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況及其隨時(shí)間的變化，同時(shí)研究該變化與大鼠頜面部的疼痛是否具有一致性，以期為進(jìn)一步探索三叉神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制提供思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)自四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買8～10周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠，體重230 g±20 g，無(wú)疾患。大鼠在室內(nèi)溫度25℃±2℃的空調(diào)房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，食物及水源充足。所有大鼠均符合國(guó)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求，在正常晝夜節(jié)律下飼養(yǎng)3 d，待適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)共使用了48只大鼠，隨機(jī)抽取8只作為空白對(duì)照組，再隨機(jī)將剩余40只分為IoN-CCI組及假手術(shù)組（各20只），2組中各8只用于行為學(xué)觀察、機(jī)械痛閾測(cè)試及體重測(cè)量，至第30天處死取材，其余12只分別在術(shù)后第1、5、10、15天處死取材。

1.2 眶下神經(jīng)部分結(jié)扎動(dòng)物模型的建立

按照體重50 mg·kg-1體重的劑量經(jīng)由腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，將大鼠仰面固定在手術(shù)臺(tái)上，使用開(kāi)口器打開(kāi)大鼠上下頜，碘伏消毒后，經(jīng)上腭第二橫皺襞與右側(cè)頰黏膜轉(zhuǎn)折處切開(kāi)3～5 mm切口，用自制圓頭探針經(jīng)切口探入，緊貼大鼠上頜骨向眶下緣滑動(dòng)，向內(nèi)向上勾拉，可見(jiàn)眶下神經(jīng)（圖1A）。IoN-CCI組采用5-0絲線結(jié)扎眶下神經(jīng)，松緊以使其略小于該神經(jīng)的直徑、稍微減緩神經(jīng)表面的血流通過(guò)但不至完全阻滯為宜。兩結(jié)之間間隔約2 mm。假手術(shù)組稍稍勾拉神經(jīng)組織，不予結(jié)扎。隨后4-0絲線縫合傷口1針。手術(shù)過(guò)程如圖1所示。

圖1 眶下神經(jīng)結(jié)扎實(shí)驗(yàn)過(guò)程Fig 1 Experimental process of infraorbital nerve ligation

1.3 體重變化測(cè)量

在相同的環(huán)境、采用相同的飼料喂養(yǎng)大鼠。在手術(shù)當(dāng)天（術(shù)前）及術(shù)后第1、5、10、15、30天測(cè)量大鼠體重，以空白對(duì)照組作為對(duì)比，觀察口內(nèi)開(kāi)口對(duì)大鼠體重的影響，輔助判斷手術(shù)對(duì)進(jìn)食的影響。

1.4 行為學(xué)變化觀察

將大鼠放置在下方通氣的透明玻璃盒（26 cm×14 cm×16 cm）中，保證大鼠可以在其內(nèi)自由活動(dòng)，待其適應(yīng)至少5 min后，開(kāi)始觀察大鼠。每只大鼠觀察10 min，采用計(jì)時(shí)器計(jì)算大鼠搔抓面部（face-grooming）累積時(shí)間。搔抓面部時(shí)間計(jì)入標(biāo)準(zhǔn)為：1）大鼠用前肢觸碰手術(shù)側(cè)觸須墊及鼻尖部分；2）觸碰頭頂或身體其他部分不計(jì)入；3）僅觸碰非手術(shù)側(cè)不計(jì)入。觀察人員預(yù)先不知道大鼠分組情況。

1.5 機(jī)械痛閾測(cè)試

大鼠在進(jìn)行機(jī)械痛閾測(cè)試之前5 d適應(yīng)環(huán)境，并在正式測(cè)試前3 d進(jìn)行適應(yīng)性測(cè)驗(yàn)。機(jī)械痛閾通過(guò)電子Von Frey測(cè)痛儀測(cè)量。將大鼠放入塑料錐形限制器（長(zhǎng)度25 cm）中，于前開(kāi)口完整露出頭部及前肢，保證其頭部可以自由擺動(dòng)（圖2）。待大鼠平靜5 min后，將纖維絲靠近大鼠眶下神經(jīng)感受區(qū)（觸須墊及其附近皮膚），以非常緩慢的速度加力。電腦端顯示出隨力值逐漸增高的坡形曲線，當(dāng)大鼠出現(xiàn)頭部回縮、偏向?qū)?cè)或用前肢攻擊探針時(shí)，加力被動(dòng)停止，以該曲線的最大力值為痛閾。待大鼠休息3 min后，再次重復(fù)上述操作。操作中避免反復(fù)戳同一個(gè)點(diǎn)造成組織損傷導(dǎo)致測(cè)量偏差。每只大鼠進(jìn)行3次，以最大值為其痛閾。在術(shù)前（0 d）和術(shù)后第1、5、10、15和30天分別測(cè)量IoN-CCI組及假手術(shù)組手術(shù)同側(cè)及對(duì)側(cè)的痛閾，衡量大鼠痛閾變化。

圖2 電子Von Frey纖維絲測(cè)試痛閾Fig 2 Pain threshold detection using electronic Von Frey fila‐ment

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

將大鼠按照50 mg·kg?1體重的劑量經(jīng)由腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，待麻醉后開(kāi)胸，灌注針從心間插入左心室，用止血鉗固定，再用剪刀剪開(kāi)右心耳，開(kāi)始灌注生理鹽水，待肝臟變白后繼續(xù)灌注4%多聚甲醛。灌注完成后，用剪刀剪開(kāi)顱頂皮層，暴露顱骨，止血鉗沿枕骨大孔處將顱骨剝開(kāi)，去除大腦組織，再輕輕地將小腦剝?nèi)ィ┞堆铀杞M織，將延髓鈍性分離后，切取Sp5C組織（圖3）。

圖3 三叉神經(jīng)核脊束尾側(cè)核取材位置Fig 3 Location of spinal trigeminal nucleus caudal part

1.7 免疫組織化學(xué)染色

組織在4%多聚甲醛中固定24～48 h，脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。石蠟標(biāo)本連續(xù)切片（厚5 μm），經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，冷卻至室溫后行大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物鈣離子結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）抗體（1∶1 000，Cell Signaling Technologie公司，美國(guó)）免疫組織化學(xué)常規(guī)染色。光鏡下觀察Iba-1在Sp5C中的表達(dá)和分布情況并拍照。使用Image-J軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組別與時(shí)間的影響采用重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析。2組間同時(shí)間點(diǎn)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組以上則采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對(duì)差異進(jìn)行評(píng)估，并采用LSD進(jìn)行事后比較。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重變化

空白對(duì)照組、假手術(shù)組、IoN-CCI組大鼠體重隨時(shí)間變化見(jiàn)表1。術(shù)前及術(shù)后第1天3組間體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后第5天IoN-CCI組體重開(kāi)始低于空白組，并持續(xù)到第30天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。IoN-CCI組術(shù)后第30天的體重為360.50 g±10.06 g，比空白對(duì)照組 （381.62 g±8.66 g）低5.51%。

表1 各組大鼠體重變化Tab 1 Changes in body weight of rats of every group g，n=8

2.2 行為學(xué)變化

眶下神經(jīng)部分結(jié)扎對(duì)大鼠搔抓面部行為的影響見(jiàn)圖4。大鼠搔抓面部時(shí)間的變化受術(shù)后時(shí)間（P<0.01）和組別的影響（P<0.01）。對(duì)同時(shí)間點(diǎn)的搔抓面部時(shí)間進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，IoNCCI組在術(shù)后第1天（P<0.05）、第5天（P<0.01）、第10天 （P<0.01）、第15天 （P<0.05）、第30天（P<0.05）的搔抓面部時(shí)間高于假手術(shù)組。

圖4 各組大鼠搔抓面部時(shí)間的變化Fig 4 Changes in face-grooming time of rats of every group

2.3 機(jī)械痛閾變化

IoN-CCI組與假手術(shù)組機(jī)械痛閾的變化見(jiàn)圖5。按照眶下神經(jīng)結(jié)扎與否、手術(shù)同側(cè)與對(duì)側(cè)，總共分為4組，重復(fù)測(cè)量的雙向方差分析表明，機(jī)械痛閾受到組別和手術(shù)后時(shí)間的影響（P<0.01）。術(shù)前及術(shù)后第5天，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而術(shù)后第1、10、15、30天，IoN-CCI組手術(shù)同側(cè)痛閾低于假手術(shù)組同側(cè)（均P<0.05），尤其第10天最為明顯。IoN-CCI組同側(cè)、假手術(shù)組同側(cè)及假手術(shù)組對(duì)側(cè)3組間術(shù)后痛閾差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5各組大鼠頜面部機(jī)械痛閾變化Fig 5 Changes of maxillofacial mechanical pain threshold of rats of every group

2.4 Sp5C中Iba-1表達(dá)變化

圖6 示通過(guò)免疫組織化學(xué)標(biāo)記Iba-1的染色情況。圖6A可見(jiàn)，與假手術(shù)組相比，IoN-CCI組手術(shù)側(cè)Iba-1表達(dá)在術(shù)后第5～15天增加且集中分布在Sp5C。圖6B為IoN-CCI組手術(shù)同側(cè)及對(duì)側(cè)Iba-1表達(dá)比較情況，可見(jiàn)同側(cè)Sp5C區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加且明顯激活，對(duì)側(cè)則呈零星分布且激活不明顯。圖6C為假手術(shù)組同側(cè)、IoN-CCI組對(duì)側(cè)、IoN-CCI組同側(cè)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況定量分析。重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析表明，Iba-1的表達(dá)受組別和時(shí)間的影響（均P<0.01）。IoN-CCI同側(cè)的Iba-1表達(dá)水平在術(shù)后第1天至術(shù)后第15天與自身對(duì)側(cè)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），IoN-CCI同側(cè)Iba-1表達(dá)水平在術(shù)后第10天達(dá)到峰值，至第30天與假手術(shù)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由于小膠質(zhì)細(xì)胞的變化是動(dòng)態(tài)且可循環(huán)的，因此根據(jù)文獻(xiàn)資料[7-8]將其大致分為3種：1）分支狀：未激活狀態(tài)，小膠質(zhì)細(xì)胞胞體卵圓，分出細(xì)小分支；2）中間狀：小膠質(zhì)細(xì)胞胞體狹長(zhǎng)，分支變少；3）變形蟲(chóng)樣：激活狀態(tài)，基本不可見(jiàn)細(xì)小分支，胞體形狀不規(guī)則，染色更深。圖6D為各組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)圖，黑色箭頭示意分支狀，藍(lán)色箭頭示意中間狀，紅色箭頭示意變形蟲(chóng)狀。

圖6 各組小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況隨時(shí)間的變化Fig 6 Changes in microglia activation over time of every group

圖6E 為各組小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成比分析結(jié)果。IoN-CCI 組同側(cè)分支狀小膠質(zhì)細(xì)胞占比在術(shù)后第5天至第15 天低于同時(shí)間點(diǎn)IoN-CCI 組對(duì)側(cè)（均P<0.01），術(shù)后第10天、第15天低于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組同側(cè)（均P<0.05），與之對(duì)應(yīng)的是變形蟲(chóng)樣小膠質(zhì)細(xì)胞占比增加。IoN-CCI組對(duì)側(cè)從始至終并未觀察到變形蟲(chóng)樣細(xì)胞。IoN-CCI組同側(cè)變形蟲(chóng)樣細(xì)胞在術(shù)后第5 天至第15 天占比在30%～40%之間，術(shù)后第30天未見(jiàn)。

3 討論

三叉神經(jīng)的三大分支分別為眼神經(jīng)、上頜神經(jīng)以及下頜神經(jīng)，這三條神經(jīng)的末端分支分別為眶上神經(jīng)、眶下神經(jīng)和下牙槽神經(jīng)[9]。眶下神經(jīng)是感覺(jué)神經(jīng)，支配口頜面區(qū)的感覺(jué)功能，其損傷會(huì)引起頜面部的疼痛但不會(huì)造成功能障礙[10]，且由于解剖學(xué)位置的關(guān)系，眶下神經(jīng)結(jié)扎更為方便，因此三叉神經(jīng)痛模型的建立首選對(duì)眶下神經(jīng)進(jìn)行慢性壓迫損傷[11]。而即便是對(duì)相對(duì)容易的眶下神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎，操作仍較為復(fù)雜[12]，過(guò)程中可能對(duì)眼球造成損傷，建模難度較大。近年來(lái)研究[13-14]報(bào)道了更為簡(jiǎn)便的建模方式，但手術(shù)切口在眶下神經(jīng)分布區(qū)域，對(duì)疼痛的評(píng)估造成一定的干擾。經(jīng)口內(nèi)開(kāi)口建立眶下神經(jīng)慢性壓迫性損傷的大鼠三叉神經(jīng)痛動(dòng)物模型在1997 年由Imamura 等[15]提出，由于開(kāi)口在口內(nèi)，對(duì)大鼠的進(jìn)食造成影響。本研究通過(guò)體重輔助判斷大鼠營(yíng)養(yǎng)狀況，雖然IoN-CCI組與假手術(shù)組、空白對(duì)照組有差異，但I(xiàn)oN-CCI組體重自手術(shù)后至第30 天均在大鼠體重的正常參考值內(nèi)[16]，未出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良。

進(jìn)行眶下神經(jīng)部分結(jié)扎后，本研究以搔抓面部的持續(xù)時(shí)間作為自發(fā)性疼痛的觀察指標(biāo)，觀察到IoN-CCI 組與假手術(shù)組大鼠在術(shù)后第1 天搔抓面部持續(xù)時(shí)間均有升高，但假手術(shù)組在術(shù)后第5天搔抓面部時(shí)間即有下降，第10 天基本回到基線，筆者猜測(cè)術(shù)后搔抓面部時(shí)間的短暫增高可能是由于手術(shù)的創(chuàng)傷或者術(shù)中對(duì)眶下神經(jīng)輕微的勾拉導(dǎo)致的；而IoN-CCI 組搔抓面部時(shí)間在術(shù)后持續(xù)升高，至第30 天仍高于假手術(shù)組。結(jié)合大鼠頜面部痛閾變化的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行眶下神經(jīng)部分結(jié)扎后，大鼠結(jié)扎側(cè)機(jī)械痛閾在術(shù)后第10 天降至最低，后逐漸升高，且在第10 天后均明顯低于非手術(shù)側(cè)以及假手術(shù)組。而在術(shù)后第1 天及第5天，IoN-CCI 組及假手術(shù)組的同側(cè)痛閾變化趨勢(shì)基本一致，均為術(shù)后第1 天降低，術(shù)后第5 天基本恢復(fù)至基線水平，而直到術(shù)后第10 天組間出現(xiàn)明顯差異。筆者推測(cè)假手術(shù)組術(shù)后第1天痛閾降低可能是由于手術(shù)創(chuàng)傷引起的炎性反應(yīng)，而手術(shù)組同側(cè)術(shù)后第5天出現(xiàn)短暫的痛閾上升可能因?yàn)槭中g(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的局部神經(jīng)水腫反應(yīng)[17]。

小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況與行為學(xué)變化和機(jī)械痛閾的變化基本一致。同時(shí)，IoN-CCI組同側(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞占比也出現(xiàn)了變化：分支狀小膠質(zhì)細(xì)胞占比先降低后回升，變形蟲(chóng)樣小膠質(zhì)細(xì)胞占比先增高后降低。當(dāng)神經(jīng)發(fā)生損傷后，受損的神經(jīng)元及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛調(diào)節(jié)通路發(fā)生變化，通過(guò)大量神經(jīng)遞質(zhì)及其他物質(zhì)的作用，導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛的發(fā)生和維持[18]。損傷導(dǎo)致痛覺(jué)傳入神經(jīng)出現(xiàn)明顯的自發(fā)性沖動(dòng)，同時(shí)伴隨電壓門(mén)控鈉通道m(xù)RNA水平增加[19]，降低動(dòng)作電位閾值，二者的共同作用下，引起異位沖動(dòng)發(fā)生并沿著痛覺(jué)傳遞通路到達(dá)感覺(jué)皮層，引起自發(fā)性疼痛[20-21]。同時(shí)，受損神經(jīng)支配區(qū)域附近的痛覺(jué)傳入纖維中發(fā)生異位神經(jīng)活動(dòng)，導(dǎo)致脊髓背角內(nèi)的興奮性氨基酸及神經(jīng)肽釋放，引起第二級(jí)痛覺(jué)神經(jīng)元突觸后變化，誘導(dǎo)神經(jīng)元過(guò)度興奮，導(dǎo)致原本不足以引起疼痛的觸覺(jué)刺激均可導(dǎo)致疼痛信號(hào)的傳遞，即痛閾降低。同時(shí)，神經(jīng)損傷可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活，激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，且能分泌大量炎癥因子及神經(jīng)毒性分子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、一氧化氮合酶及活性氧等，通過(guò)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展與維持[22]。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與疼痛發(fā)生和維持的同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力的提升對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)的維持和修復(fù)也有著重要意義。

本研究通過(guò)Iba-1 免疫組織化學(xué)染色觀察到眶下神經(jīng)結(jié)扎引起大鼠同側(cè)Sp5C 中小膠質(zhì)細(xì)胞激活，同時(shí)探索到激活水平隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，該趨勢(shì)與眶下神經(jīng)結(jié)扎引起的頜面部疼痛變化相似，說(shuō)明通過(guò)眶下神經(jīng)結(jié)扎建立的三叉神經(jīng)痛動(dòng)物模型可引起三叉神經(jīng)核小膠質(zhì)細(xì)胞激活，且頜面部疼痛變化趨勢(shì)與小膠質(zhì)細(xì)胞激活具有一致性。

本研究也有一些不足之處。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道選擇8～10 周齡大鼠建立IoN-CCI 模型，而臨床上三叉神經(jīng)痛患者年齡偏大，若采用中年大鼠（約20個(gè)月）會(huì)更加貼近臨床三叉神經(jīng)痛的患病人群。同時(shí)，本研究缺乏對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞激活機(jī)制的研究，后續(xù)將會(huì)以IoN-CCI 為模型探究Sp5C 中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活模式的相關(guān)信號(hào)通路，期望找到關(guān)鍵靶點(diǎn)，為安全有效地治療三叉神經(jīng)痛提供新的可能。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。