持續靜壓力作用下牙周膜細胞骨保護素、核因子-κB受體活化因子配體表達的增齡性變化

吳潔 崔占琴 韓瑜 李文靜

1.河北醫科大學第二醫院口腔正畸科，石家莊 050000；2.石家莊市人民醫院口腔科，石家莊 050011；3.河北醫科大學第二醫院口腔內科，石家莊 050000

近年來，隨著人們面部審美觀念及口腔健康意識的增強，成人正畸矯治比例逐年增加。但臨床工作中發現，相同時間相同牽引力下大齡患者正畸過程牙移動速度較年輕患者慢，導致臨床醫生實施成人矯治難度增大，患者就診周期延長。

骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear fac‐tor-κB ligand，RANKL） /核因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK） 系統是正畸過程中重要的破骨通路[1-2]。人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，HPDLCs） 是參與正畸骨改建的主要效應細胞[3]。HPDLCs 表達OPG、RANKL 因子[4-5]。OPG/RANKL 的比值可提示骨吸收過程的狀態，比值減小時骨吸收加快；比值增大時骨吸收被抑制[6]。增齡變化是指生物體的細胞、器官隨著年齡的增長發生結構退化、功能下降的一種現象[7]。本實驗即通過觀察不同年齡組人群HPDLCs 在體外持續靜壓力刺激下OPG、RANKL 的表達，探索增齡因素通過OPG/RANKL/RANK 通路對正畸壓力側骨改建產生影響的作用機制，以期為臨床不同年齡段患者的正畸治療提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國），青霉素/鏈霉素溶液（上海碧云天生物科技有限公司），胎牛血清（PAN 公司，德國），0.25%胰蛋白酶、PBS（BI公司，以色列），CK19（杭州華安生物技術有限公司），通用型SP試劑盒（上海中杉金橋生物技術有限公司），β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（Biosharp，合肥蘭杰柯國際貿易有限公司），人OPG 酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司），人RANKL ELI‐SA 試劑盒（武漢愛博泰克生物技術有限公司）。

1.2 HPDLCs原代培養及鑒定

取自河北醫科大學第二醫院口腔頜面外科門診收集因治療需要拔除的健康離體牙，根據年齡分為 A 組 （13～18 歲）、B 組 （19～29 歲）、C 組（30～44歲）。所有納入個體均無系統性疾病，無家族遺傳疾病史。所有納入牙齒牙周狀況良好，均無齲壞，完整拔出。本實驗已經河北醫科大學第二醫院倫理委員會批準（倫理號2021-R243），取材前均征求患者及家屬同意。

手術刀片刮取離體牙根中1/3 的牙周膜，組織塊法原代培養HPDLCs并傳代。取第4代生長良好的HPDLCs 制備細胞爬片，蘇木精-伊紅（hema‐toxylin-eosin，HE）染色觀察細胞形態，免疫組織化學染色鑒定細胞來源。

1.3 CCK-8檢測HPDLCs增殖能力

取第4 代生長良好的HPDLCs，調整細胞密度至每毫升 2×104個，每孔 100 μL 接種于 96 孔板，置培養箱中過夜，分別于第0、1、3、5、7天使用CCK-8試劑盒檢測HPDLCs增殖能力。

1.4 SA-β-Gal檢測細胞衰老

將各組第4 代生長良好的HPDLCs以密度至每毫升5×104接種于6孔板中，培養箱中常規培養。待細胞長至孔底面積60%～70%，進行SA-β-Gal 染色，光鏡下觀察到細胞藍染記為陽性。

1.5 HPDLCs靜態加壓

本實驗使用HPDLCs 靜態加壓裝置[8-9]（圖1）。將定制的壓強值為2 g·cm?2的圓形玻璃片置于接近鋪滿單層HPDLCs 的平底六孔板中，模擬正畸壓力側受力情況。

圖1 體外模擬正畸壓力裝置Fig 1 Static mechanical pressure sketch

1.6 ELISA 檢測各組 HPDLCs OPG、RANKL 蛋白表達

根據已有的年齡分組，每組又按照加力時間分為8個小組，分別給予0、1.5、3、6、12、24、48、72 h 持續靜壓力刺激，每個時點設3個樣本，每個小組均設有空白對照，分別收集壓力組及空白對照組各個時間點的細胞培養上清，ELISA 試劑盒檢測各組OPG、RANKL蛋白表達。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件對實驗結果進行統計分析，采用方差分析及獨立樣本t檢驗進行數據分析。檢驗標準為α=0.05，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HPDLCs原代培養

倒置相差顯微鏡下觀察3 組細胞的培養情況，具體見圖2。A、B、C 組細胞爬出時間為（5±2）、（7±2）、（10±3） d。A、C 組之間比較差異具有統計學意義（P<0.05），其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。

圖2 HPDLCs的培養 倒置相差顯微鏡 ×50Fig 2 Culture of HPDLCs inverted phase contrast microscope ×50

2.2 HPDLCs的鑒定

HE 染色觀察可見：胞體為長梭形或星形，胞質嗜伊紅，胞核嗜堿性（圖3A）；免疫組化染色觀察可見：角蛋白染色陰性（圖3B），波形蛋白染色陽性（圖3C），結合取材部位，判定所培養細胞為HPDLCs。

圖3 HPDLCs的鑒定 ×200Fig 3 Idification of HPDLCs ×200

2.3 CCK-8檢測HPDLCs增殖能力

培養7 d后A、B、C組細胞量差異有統計學意義 （P<0.01），A 組>B 組>C 組，3 組組間兩兩比較結果差異均具有統計學意義（P<0.05）（圖4）。

圖4 HPDLCs生長曲線Fig 4 HPDLCs growth curve

2.4 SA-β-Gal檢測衰老HPDLCs

A、B、C 組細胞 SA-β-Gal 陽性染色率分別為2.1%±0.2%、4.2%±0.5%、7.2%±1%，3 組兩兩比較差異均具有統計學意義（P<0.05）（圖5）。

圖5 SA-β-Gal染色 × 50Fig 5 SA-β-Gal staining × 50

2.5 ELISA檢測OPG、RANKL蛋白表達

空白對照組內比較可見，相同時間點OPG 蛋白表達量隨年齡增長而增加（P<0.01）（表1，圖6A），RANKL 蛋白表達量隨年齡增長而下降（P<0.05）（表2，圖6B）；壓力組OPG、RANKL 蛋白濃度均隨加力時間延長而增加，且OPG 蛋白表達水平隨年齡增長而增加（P<0.01），RANKL蛋白表達水平隨年齡增長而下降（P<0.01），OPG/RANKL蛋白比值隨加力時間呈先下降后增加趨勢，且隨年齡增長而增加（P<0.01）（表1、2，圖7）。壓力組與空白對照組比較：OPG加力前后比較，A、B、C 三組差異均具有統計學意義（P<0.05）；RANKL加力前后比較，A、B、C 三組差異均具有統計學意義（P<0.01）。OPG/RANKL比值加力前后比較，A、B、C 三組差異均具有統計學意義（其中A、B組P<0.01，C組P<0.05）（圖8～10）。

圖7 壓力組蛋白表達Fig 7 Protein expression in pressure group

圖8 A組加力前后蛋白表達Fig 8 Difference of protein expression between control and pressure group in group A

表2 空白對照組和壓力組RANKL蛋白表達Tab 2 The expression of RANKL in control group and pressure group

表2 空白對照組和壓力組RANKL蛋白表達Tab 2 The expression of RANKL in control group and pressure group

注：組間比較：a表示與A 組比較差異具有統計學意義（P<0.05）；b表示與B 組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。空白對照組內比較：c、d、e、f、g分別表示同組內與6、12、24、48、72 h比較差異具有統計學意義（P<0.05）。壓力組內比較：A組組內除0 h與1.5 h比較外，其余各個時間點兩兩比較差異均具有統計學意義（P<0.05）；B 組組內除0 h與1.5 h、48 h與72 h比較外，其余各個時間點兩兩比較差異均具有統計學意義（P<0.05）；C 組組內除0 h 與1.5 h、24 h 與12 h、24 h 與48 h 比較外，其余各個時間點兩兩比較，差異均具有統計學意義（P<0.05）。

C組0.233 6±0.016 9 0.647 8±0.187 9 1.503 2±0.159 6a 2.857 8±0.515 2a 5.052 6±0.701 2a 5.390 3±0.992 6ab 6.185 1±0.376 6ab 7.182 3±0.722 1ab加力時間/h 0 1.5空白對照組壓力組B組0.266 4±0.016 9cdefg 0.314 7±0.044 2cdefg 0.493 1±0.024 0defg 0.848 2±0.226 2 1.350 8±0.254 4ef 2.482 7±0.664 0cdf 2.759 4±0.334 9cd 3.289 7±0.611 0cdef B組0.239 6±0.011 6 0.870 8±0.073 0 1.867 6±0.175 5 3.396 0±0.787 2a 5.515 7±0.891 5a 6.458 1±0.402 6a 7.546 9±0.854 6a 8.386 9±0.291 8a 3 6 1 2 C組0.284 1±0.016 9defd 0.306 8±0.066 3defg 0.458 8±0.053 1defg 0.775 5±0.257 1 1.195 9±0.242 9 2.140 1±0.337 1cd 2.595 9±0.223 5acd 2.952 0±0.453 0cde A組0.272 8±0.016 9cdefg 0.340 4±0.026 6cdefg 0.533 8±0.059 7defg 0.908 6±0.159 6 1.6608±0.267 0cef 2.620 5±0.597 2cdf 3.109 3±0.434 9cd 3.425 3±0.342 4cde A組0.278 3±0.015 2 0.948 5±0.011 7 2.580 0±0.099 4 4.749 3±0.138 3 6.893 3±0.754 3 8.889 2±0.714 8 10.003 4±0.864 6 11.602 8±0.768 5 24 48 72

圖6 空白對照組蛋白表達Fig 6 Protein expression in control group

表1 空白對照組和壓力組OPG蛋白表達Tab 1 The expression of OPG in control group and pressure group

表1 空白對照組和壓力組OPG蛋白表達Tab 1 The expression of OPG in control group and pressure group

注：組間比較：a表示與A 組比較差異具有統計學意義（P<0.05）；b表示與B 組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。空白對照組內比較：除A 組組內0 h 與1.5 h 比較外，A、B、C 三組組內其他時間點兩兩比較差異均具有統計學意義（P<0.05）；壓力組內比較：A、B、C三組組內各個時間點兩兩比較差異均具有統計學意義（P<0.05）。

壓力組C組5.414 9±0.584 3 16.026 6±0.229 2 31.461 7±0.496 7 40.096 1±0.740 6a 97.437 3±1.609 0ab 133.845 6±1.492 3ab 174.224 2±1.938 0ab 235.264 5±2.483 3ab加力時間/h B組5.393 2±0.339 6 15.608 5±0.947 9 30.479 7±0.455 6 38.826 7±1.991 5a 92.129 1±1.517 5a 124.568 2±3.128 9a 169.217 1±2.799 3a 229.489 3±1.606 0a A組5.572 0±0.347 4 7.866 4±0.976 6 12.771 9±0.754 20.153 3±1.967 5 37.565 4±1.529 6 59.576 6±1.804 9 73.786 7±2.926 9 84.806 0±1.875 5空白對照組B組5.845 4±0.445 1 8.499 1±0.962 6 14.372 8±0.516 0 23.958 3±1.044 7a 40.235 7±1.711 2a 65.217 5±1.443 9a 77.833 1±1.850 0a 90.283 1±1.679 8a C組5.521 6±0.196 9 9.899 7±0.843 3 15.606 0±0.605 0a 25.938 6±1.3967 a 42.015 8±1.996 7a 71.085 0±1.644 1ab 80.485 9±1.644 3ab 96.120 2±1.436 2ab A組5.571 4±0.179 6 15.221 4±0.714 3 29.084 1±0.930 4 33.594 7±1.175 3 89.030 9±1.384 9 118.093 8±1.172 1 162.248 3±3.692 5 224.321 6±1.799 0 0 1.5 3 6 1 2 24 48 72

3 討論

近年來研究提示，成人正畸出現的牙槽骨吸收、牙齒移動遲緩現象，可能與機體增齡因素引起牙周組織OPG、RANKL 表達水平的變化有關。Kawasaki 等[10]通過監測正畸牙移動168 h 期間青少年與成人的牙齒移動量差異并采用ELISA 法測定齦溝液中OPG、RANKL 表達的差異，發現青少年齦溝液中的OPG/RANKL 比值低于成人，青少年的牙齒移動量大于成人。劉艷等[11]構建了大鼠正畸實驗模型，免疫組織化學檢測了牙周組織內RANKL 表達變化，結果表明與成年鼠相比，相同力值作用下早期幼年鼠RANKL表達量較高，牙齒移動速度較快。

George 等[12]對成年人及青少年臨床加載大小相當的正畸力，采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法檢測正畸牙移動第7、14、28 天牙周組織中細胞因子表達，結果表明除第28天成年人OPG 表達較高外，其余時間青少年OPG、RANKL 表達強于成年人。以往研究多為構建動物模型或臨床直接獲取正畸患者齦溝液檢測不同年齡段OPG、RANKL表達差異。

以往研究顯示壓力刺激可影響OPG、RANKL蛋白的表達水平，引起OPG/RANKL比值變化，從而導致正畸壓力側骨吸收。張瑞林等[13]通過21 d連續監測大鼠壓力側牙移動距離、Micro CT 觀察牙槽骨變化，免疫組織化學染色壓力側牙周組織切片，發現隨加力時間延長大鼠正畸牙壓力側RNAKL和OPG蛋白表達水平先增加后降低，破骨細胞數目增加，移動距離逐漸增大。RANKL、OPG 表達呈現時序性特征變化，即受壓后RANKL表達較早出現增加，隨之OPG 表達增加，OPG 表達高峰出現在RANKL 表達高峰之后。柏思羽等[14]體外對牙周膜細胞施加機械壓應力，PCR 測定OPG、RANKL 表達發現壓力刺激后OPG 表達下降，RANKL 表達上升。本研究發現壓力加載后，OPG、RANKL 蛋白表達較空白對照組增加；RANKL 蛋白表達隨加力時間延長而增加；OPG 蛋白水平在0～6 h 緩慢增加，6 h 之后表達量增長幅度較大；OPG/RANKL 比值先下降后增加。認為OPG/RANKL 比值的變化是通過RANKL、OPG 蛋白表達的時序性特征實現，RANKL 蛋白較早的反應導致壓力側的OPG/RANKL 比值下降，形成正畸壓力側骨吸收。此后OPG 蛋白通過機體一系列信號轉化后形成增加，OPG/RANKL比值較之前有所增長，骨吸收減緩，直至比值逐漸接近空白對照組，重新恢復骨平衡，與張瑞林等[13]的研究結果相似。壓力作用下OPG 的表達變化以往研究未見明確結論，本研究發現壓力刺激可導致OPG 蛋白表達水平逐步升高，認為OPG 表達的增加作為一種負反饋機制，更好地維持壓力側骨改建平衡有積極意義。為保證加力過程中細胞狀態良好、實驗結果客觀，本研究將最長加力時間設置為72 h。后續實驗將考慮延長加力時間，深入探討壓力刺激對HPDLCs表達OPG、RANKL的影響。

圖9 B組加力前后蛋白表達Fig 9 Difference of protein expression between control and pressure group in group B

本研究主要關注增齡因素可否通過直接對HP‐DLCs 表達OPG/RANKL/RANK 通路相關蛋白水平產生影響，從而影響壓力側骨吸收。已有研究證明增齡因素可影響OPG/RANKL/RANK 通路相關蛋白表達。本研究顯示，空白對照組HPDLCs 的OPG 蛋白表達量隨年齡增長而增加，RANKL 蛋白表達量隨年齡增長而下降。本研究涉及離體牙供體年齡為13～44歲，后續試驗考慮擴大受試者年齡范圍，增加性別分組，以更全面地觀察增齡因素對OPG、RANKL表達的影響。

圖10 C組加力前后蛋白表達Fig 10 Difference of protein expression between control and pressure group in group C

目前體外分離培養HPDLCs 的技術已經基本成熟，常見的培養方法有組織塊法、酶消法、酶消組織塊法等。但隨供體年齡增長，細胞培養難度增加、成功率下降。本研究收集培養13～44 歲HPDLCs，均獲得成功，可能與培養細胞時采用高濃度血清及使用刀片刮取獲得的組織塊較小有關。1）本實驗采用組織塊法體外分離培養HPDLCs，刀片小塊刮取根中1/3 的HPDLCs，既能防止酶消法對細胞的損傷，又能避免后期對組織的剪切，使培養出的細胞更具生物活性。2）本研究培養所用完全培養基含20%體積分數胎牛血清，較高濃度血清利于細胞生長。3）刀片刮取牙周膜組織體積較小，原代培養當天加入1 mL 培養液置于培養箱中常規培養，使組織較好貼壁。48 h 后輕柔換液，加入2 mL 培養基，此后3～5 d 換液，避免經常移動觀察。待細胞爬出再加入3～5 mL 培養液，2 d定期換液以保證細胞生長狀態良好。

體外細胞實驗模擬正畸壓力可選用靜壓力、剪切力等多種類型。本研究采用2 g·cm?2頂-底軸單向持續靜壓力對HPDLCs 直接加壓[8-9]，力值容易控制細胞受力均勻。以往研究[15-16]表明此力值無細胞毒性，細胞活性較佳。持續靜壓力裝置加力期間不改變細胞生長所需環境，以保證加力期間細胞狀態良好，較客觀模擬臨床正畸過程牙周膜參與壓力側骨改建的過程。

本研究對所獲得的不同年齡組的HPDLCs 給予體外持續靜壓力刺激進行干預，通過ELISA 法檢測OPG、RANKL 的表達，從而推測增齡因素對正畸治療過程中骨改建的影響。實驗結果證明，壓力刺激后相同時間點RANKL蛋白表達隨年齡增長而下降，OPG 蛋白表達隨年齡少量增加，OPG/RANKL 比值隨年齡增長而增加。提示體外持續靜壓力下增齡因素可調控HPDLCs 的OPG、RANKL蛋白表達。

OPG 為分泌型蛋白，RANKL 包括分泌型、膜結合型兩種。ELISA 檢測細胞培養上清只代表分泌型蛋白表達。本課題目前僅限于實驗室分子生物學范疇的研究，存在一定局限性。后續將進一步深入研究增齡因素對HPDLCs 蛋白表達水平的影響及體內作用機制，探討可否通過局部或全身應用RANKL 或OPG 調控臨床成人正畸牙齒移動速度。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。