基于UPLC-Q-TOF/MS 技術分析婦科千金膠囊化學成分

廖穎妍，汪宇馨，秦思雨，夏伯候*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學湘產大宗藥材品質評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208）

婦科千金膠囊由千斤拔、穿心蓮、金櫻根、雞血藤、黨參、功勞木、單面針、當歸8 味中藥材組成，臨床常用于治療急、慢性婦科炎癥，氣滯血瘀型原發性痛經，慢性淋病等，總方具有清熱祛濕、活血解毒、益氣補血的功效。 婦科千金方或膠囊的原藥材質量控制研究較豐富，方中單味藥材大多通過高效液相色譜法或薄層色譜法建立其指紋圖譜對其進行品質評價和質量研究，但是對于婦科千金膠囊成藥的質量控制研究手段比較欠缺，王康華等[1]首次建立了婦科千金膠囊HPLC 特征圖譜；MA 等[2]首次采用UPLC建立了20 批婦科千金膠囊的指紋圖譜， 并基于COX-2建立了抗炎生物活性測定方法；劉曉艷等[3]利用SPMEGC/MS 檢測了不同批次婦科千金片/膠囊中當歸的差異性揮發性成分，并進行了定性和半定量分析。通過查閱文獻發現，目前多用高效液相色譜法檢定其有效成分及相關含量，或者是用SPME-GC/MS 技術分析其揮發性成分[3]，但利用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用技術對其成分的分析和鑒定暫無報道。目前，《中華人民共和國藥典》中對婦科千金膠囊的質量標準控制是選擇穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量作為指標，而藥品中其他成分的含量并沒有建立質量標準。 全方位檢測藥物中主要化學成分對于進一步研究其藥效物質基礎及質量控制甚為重要。 婦科千金膠囊作為中藥大品種，其質量控制如果能夠跟臨床功效和作用機制聯動，對提升中藥復方制劑的品質大有裨益。 因此，本文采用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用技術技術對婦科千金膠囊進行快速而全面的成分分析，根據化學成分的質譜信息與數據庫、對照品、相關文獻等比對，鑒定其結構，為該藥的藥效機制研究提供科學依據。

1 儀器與材料

超高效液相色譜串聯四級桿/飛行時間質譜（安捷倫公司）；QUINTIX224-1/10 型萬之一電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；Mini-Q-Intergral 型純水機（美國Millipore 公司）；2K15 型低溫超速離心機（德國Sigma 公司）。質譜級乙腈（德國Merck 公司產品，批號：11052429939）；色譜級甲酸（美國Fisher Scientific 公司，批號：UN1779）；小檗堿（批號：DST191113-009，質量分數98%）、染料木苷（批號：DST200319-003，質量分數98%）、染料木素（批號：DST190915-002，質量分數98%）、蘆丁（DSTDL-001701，質量分數98%）均購自成都樂美天醫藥科技有限公司；原兒茶酸（批號：YZ112420，質量分數98%）、蒿本內酯（批號：YZ060122，質量分數98%）購自南京源植生物科技有限公司；黨參炔苷（批號：PCS0288-210324，質量分數 98%）、脫水穿心蓮內酯（批號：PCS0183-201210，質量分數98%）購自成都植標化純生物技術有限公司；木蘭花堿（批號：M-026-170612，質量分數98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；穿心蓮內酯（批號：110797-201103，質量分數98.7%）購自中國食品藥品檢定研究院。婦科千金膠囊（規格0.4 g/粒，批號20201109）來自株洲千金藥業股份有限公司。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：KROMASIL 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 流動相0.1%甲酸水 （A）-乙腈（B），流速0.3 mL/min，進樣量1 μL，柱溫30 ℃，梯度洗脫程序：0～15 min，15%～35% B；15～20 min，35%～70% B；20～25 min，70% B；25～27 min，70%～100% B，27～30min：100%～15%B。紫外檢測器：雙波長模式，信號A、B 的波長分別為：254、320 nm；檢測時間：30 min。

2.2 質譜條件

電噴霧離子化源，正、負離子檢測模式。 毛細管電壓為正離子3000 V，負離子3500 V，噴嘴電壓1000 V，錐孔電壓65 V，碎裂電壓175 V，霧化器溫度320 ℃，霧化器氣流8 L/min，分子量掃描范圍為m/z 100～1100，碰撞能量梯度10、40 eV，鞘氣溫度350 ℃。

2.3 供試品及對照品溶液的配制

2.3.1 混合對照品溶液 精確稱取對照品木蘭花堿、小檗堿、穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、染料木苷、染料木素、蘆丁、原兒茶酸、黨參炔苷、蒿本內酯于25 mL 容量瓶，用70%甲醇溶解定容，搖勻后備用。取一定量的上述對照品儲備液進行稀釋，制備混合對照品溶液，使各對照品濃度分別為：0.320 0、0.153 6、7.680 0、8.000 0、0.076 8、0.012 0、0.160 0、0.004 0、0.002 0、0.160 0 μg/mL，精密移取1 mL 混合對照品溶液，15 000 r·min-1的速度離心15 min （離心半徑：12 cm）取上清液，待測。

2.3.2 婦科千金膠囊試品的處理 精密稱取0.051 2 g 試品置于20 mL 錐形瓶內，用70%甲醇溶解，25 ℃超聲30 min。冷卻至室溫后定容并搖勻，15 000 r·min-1的速度離心15 min（離心半徑：12 cm），取上清液，待測。

2.4 物質鑒定

通過查閱文獻、對照品檢測，同時結合安捷倫中藥化合物數據庫，建立婦科千金膠囊化學成分數據庫，并使用MassHunter Qualitative Analysis 軟件解析各色譜峰的精確質量數、分子式、特征碎片離子，按照篩選規則為：質量數誤差≤5 mDa，質量測量準確度≤5×10-4，保留時間誤差≤0.1 s，找到源內碎片優先，同時通過與部分對照品及相關文獻比對后，人工篩選分析婦科千金膠囊中化學成分。

3 結果與分析

3.1 供試品溶液總離子流圖

精確稱取樣品粉末0.051 2 g 置于20 mL 錐形瓶內，用70%甲醇溶解，25 ℃超聲30 min。冷卻至室溫后定容并搖勻，15 000 r·min-1的速度離心15 min取上清液，注入1 μL，按照“2.1、2.2”項下條件進行實驗。混合對照品溶液基礎峰強度（BPI）。詳見圖1。

圖1 樣品正離子模式（A）和負離子模式（B）下的離子流圖

3.2 色譜峰中主要化學成分的鑒定

根據化學成分數據庫并結合相關文獻最終從婦科千金膠囊中鑒定出31 個化合物，具體信息見表1。

表1 婦科千金膠囊中化學成分的UPLC-Q-TOF/MSE 鑒定結果

續表1

3.3 生物堿類

生物堿類成分在ESI 正離子檢測模式下有良好的響應。 一共檢測出10 個生物堿類化合物成分，分別為化合物4、7、8、12、13、14、15、18、20、25。 通過與對照品和文獻資料進行對比，分別鑒定為木蘭花堿、木蘭劍毒堿、白鮮堿、非洲防己堿、藥根堿、異粉防己堿、小檗堿、兩面針堿、茵芋堿、巴馬汀，主要來自藥材單面針和功勞木。 峰號8 的化合物正離子模式下測得一級質譜準分子離子峰m/z 200.070 2[M+H]+，其二級碎片離子數據m/z 14.064 7[M+H-C2HO2]+，結合文獻鑒定化合物為白鮮堿。 對化合物14 進行分析：測得正離子模式下一級質譜準分子離子峰m/z 623.308 9[M+H]+，其二級碎片離子峰m/z 592.273 4[M+H-OMe]+、580.257 2[M+H-OMe-C]+。 當分子中存在雜原子時，裂解常發生于雜原子鄰近的碳碳鍵上，據文獻[12]對其裂解模式進行推測，鑒定為異粉防己堿，裂解途徑見如圖2。

圖2 異粉防己堿的質譜裂解途徑

3.4 萜類

共檢測出7 個萜類化合物，分別為峰號為5、11、16、17、19、21、23 的化合物。 分別解析為穿心蓮內酯、12,13-雙氫穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、7-羥基脫水穿心蓮內酯、脫氧穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、3-去氧脫水穿心蓮內酯。 均來源于藥材穿心蓮。化合物19 的準分子離子峰m/z 為335.220 7 [M+H]+，進一步破碎得到的二級碎片離子m/z 317.201 7、299.194 8、287.199 8，結合解析軟件的解析結果，對比化合物庫中脫氧穿心蓮內酯的二級碎片離子m/z 317.2017 [M+H-H2O]+、299.194 8[M+H-2H2O]+，鑒定化合物為脫氧穿心蓮內酯。

以化合物5 為例，對其進行文獻對比和解析，掃描正離子模式的一級質譜圖得到準分子離子峰：m/z 351.215 8[M+H]+，其二級質譜碎片離子數據分別為：m/z 333.206 6 [M+H-H2O]+、315.191 7 [M+H-2H2O]+、297.185 1 [M+H-3H2O]+、285.182 9 [M+H-2H2O-CH2O]+、257.151 6[M+H-2H2O-CH2O-CO]+，鑒定為穿心蓮內酯。化合物裂解時，羧基與碳原子以雙鍵形式相連的氧原子電負性較強，容易得到質子進行下一步裂解。由此對峰號5 裂解模式進行推測，鑒定為穿心蓮內酯，其裂解途徑推測見圖3。

圖3 穿心蓮內酯的質譜裂解途徑

3.5 苯酞類

通過對照品確證和參考文獻比對， 鑒定出3 個苯酞類化合物。 化合物28，通過標準品比對鑒定其為藁本內酯，來源于當歸。峰號為27 的化合物在正離子模式下準分子離子峰m/z 為191.105 9 [M+H]+，其二級質譜碎片離子峰m/z 為116.060 9、77.038 2。對比文獻中的3-丁基苯酞正離子模式下的準分子離子峰，鑒定峰號27 的化合物為3-丁基苯酞，來源于組分當歸。 對峰號為26 的化合物進行解析，掃描正離子模式的一級質譜圖得到準分子離子峰：m/z 189.090 5 [M+H]+，其二級質譜碎片離子數據為m/z 128.061 8[M+H-C2H4O2]+，鑒定為丁烯基酞內酯。 由于酯類結構容易進行水解得到R-COO-結構，氧具有較強的負電性，從而引發臨近碳碳雙鍵結構上的電子轉移，對峰號26 裂解模式進行推測，鑒定為丁烯基酞內酯，其裂解途徑推測見圖4。

圖4 丁烯基酞內酯的質譜裂解途徑

3.6 黃酮類

檢測出峰號為3、6、9、22、24、31、34、35 的化合物為黃酮類化合物。 對峰號3 的化合物，一級質譜圖準分子離子峰數據：m/z 291.086[M+H]+，其二級碎片離子為m/z:139.038 6 [M+H-C8H8O3]+，對照文獻與質譜數據，對峰號3 裂解模式進行推測，鑒定為（-）-兒茶素，其裂解途徑推測見圖5。

圖5 （-）-兒茶素的質譜裂解途徑

對峰號9 的化合物， 其一級質譜圖準分子離子峰數據：m/z 271.059 4 [M+H]+，其二級質譜碎片離子峰：m/z 153.013 [M+H-C8H6O]+、m/z 91.054 0 [M+H-C8H6O-H2O]+。對峰號24 的化合物進行分析，其一級質譜準分子離子m/z 為423.178 4 [M+H]+，二級碎片離子數據為m/z 404.348 9，解析為Flemichin D；通過對照標準品、軟件解析數據與文獻資料，峰號31 的化合物解析為（+）-兒茶素。 峰號34 的化合物一級質譜準分子離子m/z 為269.045 1[M+H]+，二級碎片離子數據為m/z 151.000 0、m/z 117.034 6，解析為芹菜素；峰號35 的化合物一級質譜準分子離子m/z 285.040 0[M+H]+，二級碎片離子數據為m/z 93.151 4，解析為山柰酚。 8 個化合物主要來自金櫻根、千斤拔、雞血藤、單面針、黨參。

3.7 有機酸類

共檢測出6 個有機酸類化合物，分別是峰號1、2、29、30、32、33 的化合物。對照標準品與文獻數據，解析化合物分別為煙酸、綠原酸[21]、原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、壬二酸，分別來自于藥材黨參、穿心蓮、雞血藤、穿心蓮、當歸、黨參。

對峰號2 進行解析，通過一級質譜圖分析得準分子離子峰為m/z 355.101 3[M+H]+，其二級碎片離子為m/z 312.082 4 [M+H-C2H2O]+、m/z 163.037 3[M+H-C2H2O-C5H9O5]+，通過對比文獻與標準品數據，鑒定其為綠原酸。 對于酸的裂解，其裂解機制與酯相似，羧基中與碳相連的氧原子易受到轟擊與質子結合引發電子重新排布從而裂解。 對峰號2 裂解模式進行推測，鑒定為綠原酸，其裂解途徑推測見圖6。

圖6 綠原酸質譜裂解途徑

3.8 苷類 檢測得峰號10 的化合物負離子模式下準分子離子峰m/z 441.175 7[M+COO]-，其二級碎片離子m/z 305.124 1、215.108 0、185.095 9、179.055 1；對比標準品，鑒定其為黨參炔苷，來源于黨參。

4 結果與討論

婦科千金膠囊屬于國家保護中藥，也是最早一批收載入國家基本藥物管理的中成藥，具有清熱除濕、活血解毒、益氣補血等功效。 總方包含千金拔、穿心蓮、金櫻根、雞血藤、黨參、功勞木、單面針、當歸8 味中藥材，由于成分復雜，以往研究主要是指紋圖譜或者少數指標性成分的定性定量分析，不足以更好地體現中藥復方制劑的整體質量。 本研究采用UPLC-Q-TOF/MS 技術，并結合在線數據庫和文獻以及標準品對婦科千金膠囊中化學成分進行分析鑒定，通過ESI 正負離子兩種模式，從婦科千金膠囊中初步鑒定出35 個化合物，其中生物堿類10 個，包括：木蘭花堿、木蘭劍毒堿、白鮮堿、非洲防己堿、藥根堿、異粉防己堿、小檗堿、兩面針堿、茵芋堿、巴馬汀。 黃酮類化合物8 個，分別為（-）-兒茶素、大豆苷、染料木素、芒柄花素、Flemichin D、（+）-兒茶素、芹菜素、山柰酚。 萜類7 個，分別為穿心蓮內酯、12,13-雙氫穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、7-羥基脫水穿心蓮內酯、脫氧穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、3-去氧脫水穿心蓮內酯。 有機酸類化合物6 個，分別為煙酸、綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、咖啡酸、壬二酸。苯酞類化合物3 個，丁烯基酞苯內酯、3-丁基苯酞、藁本內酯，糖苷類1 個為黨參炔苷。 生物堿類成分主要來自單面針和功勞木，萜類成分主要來自穿心蓮，黃酮類成分來自黨參、千斤拔、單面針、雞血藤和金櫻根，其中，木蘭花堿、木蘭箭毒堿、藥根堿、脫水穿心蓮內酯、脫氧穿心蓮內酯、茵芋堿、芒柄花素和巴馬汀的響應值很高，為后續進行質量標志物的研究以及為藥材的配伍規律研究提供了依據。 通過利用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用技術對婦科千金膠囊的化學成分進行分析可為深入研究婦科千金膠囊的藥效物質基礎和基于質量標志物的質量控制升級提供參考。