板栗堅果營養物質和抗氧化成分綜合評價

武妍妍，史文石，石新如，陳榮榮，趙 悅，趙佳冰，，王志偉，史勝青＊

(1.中國林業科學研究院林業研究所，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091；2.中國林業科學研究院成果轉化與產業開發處，北京 100091；3.中國林業科學研究院森林生態環境與自然保護研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091；4.河北省秦皇島市青龍滿族自治縣婁杖子鎮小鹿溝村，河北 秦皇島 066508)

板栗（Castanea mollissimaBl.）是殼斗科（Fagaceae）栗屬（CastaneaMill.）經濟林樹種，不僅提供品質優良的堅果，還是重要的生態恢復樹種[1-3]。板栗堅果營養豐富，以淀粉為主，同時還含有豐富的可溶性糖、蛋白質、粗脂肪、維生素C及黃酮類化合物，有“木本糧食”的美稱[4-5]。

營養品質評價是優良種質資源選育的重要步驟，目前在種質資源收集與評價方面開展了大量工作，如利用等距分級評價法[6]、模糊數學法[7]、方差分析與相關分析結合法[8]、因子分析與隸屬函數結合法[9]等對河北省燕山地區和山東省的板栗種質或主要品種從表型和營養成分等方面進行了比較研究，包括單粒鮮質量、含水量、淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉、總糖、可溶性糖、還原糖、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、灰分及礦質元素等。

板栗在采后或貯藏期間，果仁內腐病發生嚴重[10-11]。研究發現，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性維持在一個較高的水平有利于板栗貯藏[12]；POD、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性下降時內腐病發生嚴重，而增強時腐爛現象則減緩[13]，表明抗氧化酶的活性對板栗采后堅果品質的維持具有十分重要的作用。然而，目前對板栗抗性物質的研究多集中在貯藏期間以及葉、殼和花中[12-16]，在板栗種質評價中進行板栗抗性物質的研究尚且較少。

本研究在對燕山地區63個板栗種質進行營養評價[17]的基礎上，以河北省遷西縣3個板栗品種為參照，對收集的14個板栗優良單株堅果的營養物質和抗氧化成分進行分析，并采用隸屬函數-因子分析相結合的方法進行綜合評價，以期為優良板栗品種選育及采后運輸和貯藏等提供理論依據。

1 材料與方法

2020年秋季在河北省燕山地區成年板栗園（樹齡均在35年以上）收集18份種質。4份栽培品種包括燕奎、燕山短枝和燕山早豐，其中，燕山早豐分別采集于遷西縣和青龍縣2個栗園；其余14份種質在走訪農戶和實地調查的基礎上采集，選取具有高產、穩產，堅果大小均勻、品相口感好，抗病蟲、耐貧瘠、抗旱性強等特點的單株或農家種。當樹上約1/3以上栗苞自然裂開落果后，采集健康無病害的堅果。每個種質隨機取3～5 kg健康堅果，在當地冷庫（0～2 ℃）或冰箱（4 ℃）臨時貯藏后帶回實驗室。一部分稱質量烘干保存，用于營養物質和維生素C測定；一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于抗氧化成分測定。每個種質3個實驗重復，每個重復隨機選取15～20個大小均勻的堅果。

1.1 植物材料

采集的板栗種質相關信息見表1。

表1 板栗種質采集信息Table 1 Collection information of chestnut germplasms

1.2 指標測定方法

1.2.1 表型特征測定 用游標卡尺分別測量堅果的橫、縱、側徑，果形指數=堅果縱徑/橫徑[18]，體積V=(4/3)πabc（a、b、c分別代表橫徑、縱徑、側徑值的一半）[19-20]。

1.2.2 單果鮮質量和含水量測定參照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》，利用千分之一天平測定15～20個堅果鮮質量并記錄；然后，參照曹小艷等[21]方法略有修改，將每個堅果切成均等4份，放入105 ℃烘箱中殺青30 min，65 ℃烘至恒質量，測定干質量并記錄，計算單果鮮質量和含水量。

1.2.3 營養指標測定 利用蒽酮比色法測定可溶性糖、淀粉，利用氨基酸與水和茚三酮生成紫色化合物的原理測定總氨基酸，具體測定方法詳見植物可溶性糖含量試劑盒、植物淀粉含量試劑盒、氨基酸含量測定試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）。利用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白，具體測定方法詳見改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒（上海生工生物工程有限公司）。

1.2.4 抗氧化指標測定 維生素C是利用它與固藍鹽B在乙酸溶液中反應生成黃色的草酰肼-2-羥基丁酰內脂衍生物的原理測定；超氧化物歧化酶（SOD）是利用黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生的超氧陰離子與WST-8反應產生水溶性染料甲臜的原理測定；多酚氧化酶（PPO）是利用PPO能夠催化鄰苯二酚產生醌的原理測定；過氧化物酶（POD）是利用POD催化H2O2氧化特定底物的原理測定；過氧化氫酶（CAT）是利用CAT能夠分解H2O2的原理測定。具體測定方法詳見相關試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）。

總多酚含量測定：采用福林酚比色法測定[22]。稱取0.1 g樣品，加入5 mL 50%甲醇超聲波提取30 min。然后，12000 r·min-1離心10 min，去上清液至于4 ℃待測。以沒食子酸（北京世紀奧科生物技術有限公司）為標準，配置質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL-1的系列標準溶液。按照待測液/標準液:福林酚:Na2CO3溶液為1:5:4比例，分別加入10% 福林酚試劑和7.5%Na2CO3溶液，混勻后在25 ℃條件下避光放置40 min，記錄波長725 nm下吸光值A。利用標準曲線方程y=0.0056x+0.0124計算，式中，x為總多酚含量，y為吸光值A。

總黃酮含量測定：提取方法同總多酚含量測定，采用比色法測定[23]。以槲皮素（北京索萊寶科技有限公司）為標準，配制質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1的系列標準溶液。取25 μL待測液/標準液加入7.5μL 5% NaNO2，混勻，立即加入7.5μL 10% Al(NO3)3，靜置5 min，再依次加入50μL 4% NaOH和160μL 50%甲醇，混勻，靜置5 min后，在波長510 nm處測定吸光值A。利用標準曲線方程y=0.0005x-0.00005計算，式中，x為總黃酮含量，y為吸光值A。

1.3 數據分析

利用Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0軟件對原始數據進行方差分析、相關性分析和因子分析。

應用計算公式S(in)= (Xin-Ximin)/(Ximax-Ximin)對原始數據進行標準化得到隸屬函數值，其中，S(in)指第n個樣品第i個指標，Xin指第n個樣品第i個指標的原始測定值，Ximax、Ximin分別為第i個指標的最大值和最小值。之后利用因子分析篩選出影響果實品質的若干公因子，同時得到各個指標的公因子分值Fm，以每個公因子分值Fm乘以因子分析中相對應的方差貢獻率Em，最后相加得到綜合得分D，其計算公式為：

式中：Ei為樣品第i個公因子分值，Fi為第i個公因子的方差貢獻率，i=1，2，3，4……n，n為公因子的個數[24]。

2 結果與分析

2.1 板栗堅果外部特征

18份板栗種質單果鮮質量之間存在較大差異（表2），平均為9.65 g，其中，QTC的單果鮮質量最小（7.88 g），TPZ的最大（12.51 g），TPZ是QTC的1.59倍。堅果果型指數變化幅度為0.65～0.89（表2），其中，JCY-3和JSY-7的果型指數最大，均為0.89，說明這二者堅果形狀最近似圓形；而QL3113的果形指數只有0.65，說明該堅果形狀近似扁圓形。TPZ的體積最大（9.72 cm3），YZX的 體 積 最 小（6.37 cm3），TPZ體 積是YZX的1.53倍。

表2 板栗堅果外部形態特征Table 2 External morphological characteristics of chestnut nuts

2.2 板栗堅果營養物質

不同種質板栗堅果營養物質含量均有一定差異，其中，可溶性糖（24.25%）、可溶性蛋白（34.72%）的變異系數較大（表3）。含水量為45.95%～51.59%，TPZ和ZJ2的水分含量較高，分別為51.59%和51.55%。淀粉含量為38.28%～53.69%，其中，＞50.00%的有QL3113、QX3113、LJT、JCY-3、YZX、LMY-1。可溶性糖含量為4.51%～11.62%，其中，＞10.00%的有QL3113、QX3113和ZQ1。可溶性蛋白質含量為0.35%～1.15%，其中，＞1.00%的有QL3113、QX3113、QX107和ZQ1。氨基酸含量為1.03%～1.82%，其中，＞1.70%的有QX107、ZQ1、ZJ2。結果表明，ZQ1與現有栽培品種燕山早豐、燕奎比較接近，有待于深入挖掘。

表3 不同種質板栗堅果營養指標Table 3 Nut nutrient indices of different chestnut germplasms

2.3 板栗堅果抗氧化成分

表4表明：18份板栗種質中，PPO的變異系數最大（64.51%），CAT的變異系數次之（33.85%）。SOD為717.40～1 310.42 U·g-1，其中，＞1 100.00 U·g-1的有QL3113、YHZ、XCZ、TPZ、YZX、JIH。PPO為11.22～89.06 U·g-1，其中，＞80.00 U·g-1的有YZX、ZQ1、LMY-1。POD為3 009.33～5 965.33 U·g-1，其中，＞5 000.00 U·g-1的有QL3313、ZJ2、JIH。CAT為48.20～367.19 nmol·min-1·g-1，其中，＞340.00 nmol·min-1·g-1的有QL3113、LJT、JIH、QTC。維生素C含量為203.81～595.40 μg·g-1，其中，＞560.00 μg·g-1的有QL3313、JSY-7、QTC。總多酚含量為338.67～822.33 μg·g-1，其中，＞700.00 μg·g-1的有QX3113、QX107、JCY-1、XCZ、ZJ2、LMY-1。總黃酮含量 為89.67～146.00 μg·g-1，其 中，＞130.00 μg·g-1的 有QL3313、QX3113、QX107、ZQ1、ZJ2。結果表明，18份板栗種質抗氧化成分均存在較大差異，其中，ZJ2、ZQ1和QTC與燕山早豐、燕奎比較接近，有待于進一步比較分析。

表4 不同種質板栗堅果抗氧化指標Table 4 Nut antioxidant indices of different chestnut germplasms

2.4 各指標相關性分析

如表5所示：單果鮮質量與體積、含水量呈極顯著正相關，與維生素C呈極顯著負相關；可溶性糖、可溶性蛋白、氨基酸和總多酚與總黃酮呈極顯著正相關；可溶性糖、氨基酸和總黃酮與SOD呈極顯著負相關。

表5 板栗堅果品質指標相關性系數Table 5 Correlation coefficients of chestnut nut quality indices

果形指數與可溶性蛋白、總黃酮和POD呈顯著負相關，與PPO呈顯著正相關；體積與含水量呈顯著正相關；淀粉與可溶性蛋白、維生素C和總黃酮呈顯著正相關；可溶性糖與總多酚呈顯著正相關；可溶性蛋白與氨基酸、維生素C呈顯著正相關，與SOD呈顯著負相關；PPO與CAT呈顯著負相關。

2.5 不同種質板栗品質因子分析

如表6所示：在不含抗氧化酶時，因子1在總黃酮、可溶性糖和總多酚上的載荷值較大；因子2在單果鮮質量、含水量和體積上的載荷值較大；因子3在維生素C、淀粉和可溶性蛋白上的載荷值較大。3個因子累計貢獻率為67.612%。如表7所示：在含抗氧化酶時，因子1在SOD、氨基酸和總黃酮上的載荷值較大；因子2在單果鮮質量、體積和含水量上的載荷值較大；因子3在CAT、PPO和維生素C上的載荷值較大；因子4在果型指數、POD和總多酚上的載荷值較大；因子5在淀粉、可溶性糖和總黃酮上的載荷值較大。5個因子累計貢獻率為78.140%，表明所列因子可代替評價板栗的品質質量，能夠反映原始數據的大部分信息。

表6 板栗堅果品質指標因子分析（不含抗氧化酶）Table 6 Factor analysis of chestnut nut quality indices (in the absence of antioxidant enzymes)

表7 板栗堅果品質指標因子分析（含抗氧化酶）Table 7 Factor analysis of chestnut nut quality indices (in the presence of antioxidant enzymes)

2.6 板栗種質品質綜合評價

利用隸屬函數-因子分析相結合的方法，得到各個指標的公因子得分，再根據各自方差貢獻率，建立板栗營養物質和抗氧化成分綜合評價的數學模型：

式中：Fy代表綜合得分，F1～F5分別代表因子1～因子5。

由表8、9可看出：18份板栗種質品質存在顯著差異。4份栽培品種中，有或無抗氧化酶時綜合得分排名均為：QX107＞QL3113＞QX3113＞HHZ20，表明3個良種中QX107品質較好，HHZ20品質較差。除3個良種外，無抗氧化酶時綜合得分前4名分別是ZQ1、ZJ2、LMY-1，QTC；有抗氧化酶時綜合評價前4名分別是ZJ2、ZQ1、JIH、QTC。其中，QTC堅果在18份板栗種質中個頭較小。

表8 不同種質板栗堅果品質綜合評價（根據式（1））Table 8 Comprehensive evaluation of nut qualities from different chestnut germplasms(according to equation (1))

3 討論

燕山板栗種質資源豐富，遺傳多樣性復雜。對地方種質資源進行綜合評價，篩選優良、豐產、早熟型板栗，有利于地方種質品種選育和改良[25-26]。由于板栗品質受基因型、環境條件、栽培技術等眾多因素的影響[27]，因此，后續研究還需將這幾個優良種質在同一資源圃中種植后再進行比較。以往種質評價研究主要將形態特征和營養指標考慮在內，本研究發現，18份板栗種質無論是在種實特征、營養物質還是抗氧化成分方面均存在顯著差異。

18份板栗種質中淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白、氨基酸含量變異系數為10.43%～34.72%，SOD、PPO、POD、CAT、維生素C、總多酚、總黃酮變異系數為7.05%～64.51%，營養物質中以可溶性蛋白含量變異系數最大，抗氧化成分中PPO活性變異系數最大。含水量的變化范圍與杜常健等[17]對相同分布區的63份板栗種質研究結果類似，含水量影響板栗貯藏時間長短，因此，把含水量納入品質評價中具有重要意義。可溶性糖直接影響板栗的甜度和風味，其含量的高低與板栗自身抗性密切相關[28]，因此，可溶性糖是品質評價的一個重要指標。可溶性糖的變化范圍為4.51%～11.62%，比路超等[9]研究結果略高，與杜長健等[17]研究結果類似，因此，本研究為篩選含糖量較高的板栗種質提供了借鑒。淀粉可以轉化為可溶性糖，在果實品質的形成過程中發揮著重要作用[29]，是決定板栗食用品

質的最主要因素。淀粉含量的變化范圍為38.28%～53.69%，與張樂等[30]的測定結果22.89%～24.58%存在差異，原因可能是：一方面板栗不同種質差異顯著，另一方面可能是采樣區域不同。此外，可溶性蛋白也是評價板栗營養價值的重要指標。由于測定方法不同，本研究中測定的可溶性蛋白含量為0.35%～1.15%，低于張樂等[30]和劉艷等[6]測定的粗蛋白含量。

表9 不同種質板栗堅果營養品質綜合評價（根據式（2））Table 9 Comprehensive evaluation of nut qualities from different chestnut germplasms(according to equation (2))

植物病害因造成產量下降和經濟損失而受到人們廣泛關注，如板栗的葉焦枯病[31]、果仁內腐病[10-11]，柿果的頂腐病[32]。由于板栗含水量在50%左右，采后及貯藏過程中容易發生腐爛。因此，采后合理貯藏是板栗果實能夠發揮食用價值和經濟價值的關鍵一步。板栗堅果隨貯藏時間延長容易產生并積累活性氧，膜脂過氧化加劇，腐爛率增加[33]。抗氧化酶SOD、CAT和POD在板栗貯藏過程中可以通過清除果實體內的活性氧，有效阻止膜脂過氧化，降低腐爛率[12-13]，PPO與植物褐變密切相關[34]。本研究首次將4種抗氧化酶引入到板栗種質評價中，發現無論有或無抗氧化酶指標，3個良種中燕奎和燕山早豐綜合排名均在前；其余14份種質中ZJ2、ZQ1綜合排名總體在前，值得后續深入挖掘。LMY-1在無抗氧化酶指標時排名在前，但有抗氧化酶指標時排名偏后，是否意味著種質不耐貯藏，還需后續進一步驗證。

此外，抗氧化酶活性的高低與外界環境變化密切相關。有研究發現，熱處理能抑制板栗果實貯藏過程中呼吸強度以及POD、CAT活性[35]。本研究在4種抗氧化酶活性測定過程中實驗條件一致，并且在采樣過程中也盡可能保證貯藏條件相似，可以排除測定過程和采集時外部因素的干擾。另外，2種評價體系中青龍縣和遷西縣兩地栗園的燕山早豐綜合排名均在前。因此，除生長環境影響外，所獲得的抗氧化酶活性高低應該是該種質內在特征。這表明抗氧化酶可以考慮作為板栗種質評價指標。

4 結論

本研究采用外觀特征、營養物質、抗氧化成分以及新引入的4種抗氧化酶為指標，對燕山地區4份栽培品種和14份候選種質進行綜合評價發現，除栽培品種外，ZJ2和ZQ1可以作為候選優良種質深入挖掘；抗氧化酶SOD、POD、CAT和PPO可以考慮作為板栗種質評價的指標。今后將在種質資源保存圃中對這2個候選優良種質及抗氧化酶指標進行深入研究。