采前氨基寡糖素噴施通過激活苯丙烷途徑促進采后厚皮甜瓜愈傷

李寶軍，劉志恬，薛素琳，柴秀偉，李志程，畢 陽,*，Dov PRUSKY，張鋒崗

（1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.以色列農業(yè)研究組織農產品采后科學部，以色列 里雄萊錫安 7505101；3.海南正業(yè)中農高科股份有限公司，海南 海口 570216）

厚皮甜瓜果實具有愈傷能力，在受到機械損傷后，可在傷口表面形成愈傷封閉層。封閉層主要由軟木脂和木質素構成，而軟木脂主要包括聚酚軟木脂（suberin polyphenolic，SPP）和聚酯軟木脂[1]，前者由阿魏酸、肉桂酸等酚酸以酯鍵和醚鍵相互連接而成[2]，后者由ω-羥基脂肪酸、α,ω-二元酸、C16～C28中長鏈脂肪酸和脂肪醇等以酯鍵相互連接而成[3]，封閉層的形成能有效抑制水分蒸騰，抵御病原物的侵染[4]。但果實自然愈傷需要較長的時間，期間易發(fā)生失水和腐爛，因此，需要采取措施加速果實的愈傷過程。氨基寡糖素（amino oligosaccharide，AOS）是一種安全且環(huán)境友好的水溶性低聚糖，由殼聚糖通過生物降解獲得[5]。AOS具有調節(jié)植物生長發(fā)育[6]、誘導植物抗病性的作用[7-8]。有研究表明，AOS處理可有效誘導多種果實的采后抗病性，包括由Alternaria alternata引起的冬棗和杏黑斑病[9-10]、由Colletotrichum musae引起的香蕉炭疽病[11]、由Monilinia fructicola引起的桃褐腐病[12]以及由Penicillium italicum和P. digitatum引起的柑橘青霉病和綠霉病[13]。AOS誘導果實的抗病機制涉及苯丙烷代謝關鍵酶的活化以及阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸等酚類物質的積累[13]。此外，AOS還可提高柑橘果實中過氧化氫的水平[14]，上調果實中病程相關蛋白基因的表達水平，提高防御酶活力[15]。盡管已有AOS誘導果實采后病害及相關機制的報道，但AOS采前噴施是否影響采后果實愈傷尚鮮見報道。本研究用2 mL/L AOS在‘瑪瑙’厚皮甜瓜果實發(fā)育的幼果期、膨大前期、膨大后期及成熟期進行4 次噴施，評價采前噴施對采后果實愈傷期間質量損失率及病情指數(shù)的影響，觀察傷口處SPP和木質素的沉積情況，分析苯丙烷代謝關鍵酶活力和過氧化物酶活力，以及代謝產物和H2O2含量變化，以期為厚皮甜瓜的快速愈傷提供方法及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘瑪瑙’厚皮甜瓜種子購于張掖市金種源種業(yè)有限公司，種植于甘肅省民勤縣收成鄉(xiāng)，果實在花后45 d采收。選擇大小均勻、未受機械和病蟲害影響的果實，并將單個果實套網(wǎng)后裝箱，第2天運至本實驗室，在常溫（22±2）℃、相對濕度55%～65%下貯藏待用。

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）由本實驗室提供，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上保存待用。

AOS由海南正業(yè)中農高科股份有限公司提供，有效質量分數(shù)5%，聚合度在2～8之間，相對分子質量在324～1 296之間。

正己烷、亞硝酸鈉、乙酸、硝酸鋁、丙酮、硼酸、氯化羥胺、溴化乙酰 國藥集團化學試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚、中性紅 天津市光復精細化工研究所；甲苯胺藍 上海中秦化學試劑有限公司；β-巰基乙醇、鹽酸、小檗堿、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP） 北京索萊寶科技有限公司；L-苯丙氨酸上海凜恩科技發(fā)展有限公司；福林-酚、Triton X-100北京酷來搏科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CX21FSIC型光學顯微鏡、BX51型熒光顯微鏡日本奧林巴斯工業(yè)有限公司；UV-2450型紫外-可見光分光光度計 日本島津儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；H-1850R型高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；LDZX-30KBS型紫立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；1510-04087型酶標儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；DW-HL218型超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限公司；A11 basic S025型研磨機艾卡（廣州）儀器設備有限公司；MT201型電子秤深圳市美孚電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AOS溶液的配制及田間噴施

參照Wang Bin[4]和謝東鋒[16]等的方法，將AOS直接溶于自來水配制成劑量為2 mL/L（每1 mL稀釋500 倍）的水溶液。在果實發(fā)育的4 個時期（幼果期、膨大前期、膨大后期及成熟期）用2 mL/L AOS對植株和果實進行噴施。在晴天下午16—17時采用農用噴霧器噴施，每1 L藥液噴施20～25 株。以含體積分數(shù)0.1%烷基糖苷的自來水（參照海南正業(yè)公司藥劑配方）噴施作對照組。每次處理150 株，重復3 次。

1.3.2 孢子懸浮液的制備

孢子懸浮液的制備參照Ge Yonghong等[17]的方法。在培養(yǎng)T.roseum1 周的培養(yǎng)皿中加入一定量的無菌水，用涂布器均勻的刮下孢子后通過4 層厚棉布過濾并振蕩15 s，然后用血球計數(shù)板計數(shù)并將孢子濃度調至1.0×106個/mL。

1.3.3 果實的人工損傷及愈傷

參照Wang Bin等[4]的方法，甜瓜果實清洗后用體積分數(shù)1%次氯酸鈉浸泡3 min，置于室溫下晾干。隨后，使用不銹鋼剝皮器在赤道周圍刮出4 個人工傷口（10 cm×2 cm×1.2 mm）。損傷果實在常溫（22±2）℃、相對濕度55%～65%的黑暗條件下愈傷。每次處理200 個果實，重復3 次。

1.3.4 質量損失率和病情指數(shù)的測定

質量損失率的測定采用稱質量法，分別在愈傷過程中的第0、1、3、5、7天稱果實質量，每次處理9 個果實，重復3 次，質量損失率計算如公式（1）所示。

病情指數(shù)的測定參照Wang Bin等[4]的方法，甜瓜果實接種T. roseum，在果實損傷后的第0、1、3、5、7天，將20 μL上述孢子懸浮液涂布于傷口表面，黑暗常溫培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計發(fā)病級別。每次處理8 個果實，重復3 次。病情指數(shù)計算如公式（2）所示。

式中：發(fā)病級別標準分別為：5級，表面100%發(fā)病；4級，表面75%～100%發(fā)病；3級，表面50%～75%發(fā)病；2級，表面25%～50%發(fā)病；1級，表面0%～25%發(fā)病；0級，表面不發(fā)病。

1.3.5 果實愈傷過程中SPP及木質素沉積情況觀察

SPP的沉積觀察參照Fugate等[18]的方法。用不銹鋼雙面刀片垂直傷口表面切出0.2～0.3 mm厚的薄片。先用質量分數(shù)0.1%小檗堿染色45 min后，吸去染料，用蒸餾水和75%（體積分數(shù)，下同）乙醇溶液各沖洗3 遍，再用95%乙醇溶液沖洗2 遍，脫去染料，然后在質量分數(shù)0.25%甲苯胺藍中放置1～2 min進行復染，最后用蒸餾水和75%乙醇溶液洗去染料。采用熒光顯微鏡觀察切片中紫藍色SPP沉積情況。

木質素沉積情況參照Alba等[19]的方法觀察。用不銹鋼雙面刀片垂直于傷口表面切出0.2～0.3 mm厚的薄片。先用蒸餾水浸泡沖洗數(shù)遍，以除去切片組織中的淀粉顆粒，隨后置于載玻片上，滴加質量分數(shù)1%間苯三酚染色1.5 min后，再加1～2 滴濃鹽酸。采用熒光顯微鏡觀察切片中紅色木質素沉積情況。

果實愈傷組織中的SPP和木質素細胞層厚度測定參照Oirschot等[20]的方法，通過IS Capture軟件進行計算。

1.3.6 生化指標的測定

參照Wang Bin等[4]的方法，在果實愈傷的第0、1、3、5、7天，用手術刀垂直傷口表面切取下部2～3 mm處的組織，液氮冷凍后，用研磨機磨成粉末，于-80 ℃下保存，用于生化指標測定。

1.3.6.1 酶活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）活力的測定參照Koukol等[21]的L-苯丙氨酸法。取冷凍粉末3.0 g，于5 mL硼酸-硼砂緩沖液（pH 8.8，含質量濃度40 g/L PVP、2 mmol/L EDTA和5 mmol/Lβ-巰基乙醇）中，冰浴下研磨成漿狀，在4 ℃、12 000×g下離心30 min，上清液即為粗酶液。反應體系為3 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸-硼砂緩沖溶液和0.5 mL 20 mmol/L的L-苯丙氨酸，在37 ℃水浴鍋中放置10 min后加入0.5 mL粗酶液混勻后倒入比色皿中，在290 nm波長處測定吸光度作為初始值隨后將混合液在37 ℃水浴鍋中保溫1 h，結束后立即測定混合液在290 nm波長處的吸光度作為終止值。以每小時290 nm波長處吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U），PAL活力以U/gmf表示。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照姜愛麗等[22]的愈創(chuàng)木酚法。取冷凍粉末2.0 g，加入5 mL乙酸-乙酸鈉提取緩沖液（pH 5.5，含1 mmol/L PEG、質量分數(shù)4%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮和體積分數(shù)1% Triton X-100溶液），于4 ℃、8 000 r/min條件下離心30 min，收集上清液即為粗酶液。反應體系為3.0 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液、0.3 mL酶提取液和0.1 mL 0.5 mol/L H2O2溶液。反應15 s后測定混合液在470 nm波長處的吸光度，測定持續(xù)2 min，以蒸餾水作為參比。以每分鐘470 nm波長處吸光度變化1為一個活力單位（U），POD活力以U/gmf表示。

1.3.6.2 總酚和類黃酮含量的測定

總酚和類黃酮含量的測定參照Scalbert等[23]的方法。取冷凍粉末1.0 g，加入5 mL含體積分數(shù)0.5%乙酸與體積分數(shù)70%丙酮的水溶液提取愈傷組織中的總酚和類黃酮，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心30 min，收集上清液后測定其含量。于760 nm波長處測定OD值，并以沒食子酸（gallic acid，GAE）為標準物質，通過繪制該物質的標準曲線得到標準曲方程，并計算總酚含量，結果以mg/100 gmf表示。于510 nm波長處測定OD值，并以兒茶素（catechin，CE）為標準物質，通過繪制該物質的標準曲線來計算類黃酮含量，結果以mg/100 gmf表示。

1.3.6.3 木質素含量的測定

木質素含量測定參照Hammerschmidt等[24]的方法。取冷凍粉末1.0 g，加入3 mL預冷的95%乙醇溶液，于4 ℃、8 000 r/min離心30 min，棄去上清液，將沉淀物用95%乙醇溶液洗滌3 次，用乙醇與正己烷混合溶液（V（乙醇）∶V（正己烷）＝1∶2）沖洗3 次，將清洗后的沉淀物在烘箱中干燥24 h，然后溶于1 mL體積分數(shù)25%溴化乙酰-冰醋酸溶液，在70 ℃下水浴30 min，隨后加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應，再加入2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L鹽酸羥胺，于4 ℃、8 000 r/min條件下離心30 min，取上清液0.5 mL并用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm波長處測定OD值，木質素含量以OD280nm/gmf表示。

1.3.6.4 H2O2含量的測定

H2O2含量的測定參照Prochazkova等[25]的方法。取冷凍粉末1.0 g，加入3 mL冷丙酮，冰浴研磨成勻漿后于4 ℃、12 000 r/min離心20 min。取1 mL上清液，加入100 μL體積分數(shù)20%四氯化鈦溶液（V（鹽酸）∶V（四氯化鈦）＝4∶1）和200 μL濃氨水，混勻反應5 min后離心15 min。沉淀部分用冷丙酮洗滌4 次以減少色素的干擾，最后將沉淀溶于1.5 mL 1 mmol/L H2SO4溶液中，于415 nm波長處測定OD值，H2O2含量單位以μmol/gmf表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗至少重復3 次，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2019軟件計算平均值和標準誤差，采用SPSS 21.0軟件進行Duncan’s差異顯著性（P＜0.05）和Pearson’s相關性分析，用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 AOS采前噴施對采后果實愈傷期間質量損失率和病情指數(shù)的影響

隨著愈傷時間的延長，AOS噴施處理組和對照組果實的質量損失率逐漸升高，在愈傷的第5、7天，AOS組顯著低于對照組（P＜0.05），第7天時AOS噴施處理的質量損失率低于對照組28.64%（P＜0.05）（圖1A）。AOS組和對照組果實的病情指數(shù)隨著愈傷時間的延長逐漸降低，AOS組顯著低于對照組（P＜0.05），第7天時AOS噴施處理的病情指數(shù)低于對照組32.00%（P＜0.05）（圖1B）。上述結果表明，AOS采前噴施可有效促進采后厚皮甜瓜的愈傷。

圖1 AOS采前噴施對采后果實愈傷期間質量損失率（A）和病情指數(shù)（B）的影響Fig. 1 Effect of preharvest AOS sprays on mass loss (A) and disease index (B) of harvested muskmelons during wound healing

2.2 AOS采前噴施對采后果實愈傷期間傷口處SPP和木質素沉積的影響

隨著愈傷時間的延長，AOS噴施處理和對照組果實傷口處的SPP和木質素的沉積量逐漸增加，在愈傷的中后期，AOS組明顯高于對照組（圖2A、B）。同樣，AOS組和對照組果實的SPP和木質素沉積的細胞層厚度也隨愈傷時間的延長逐漸增加，第3天后AOS組顯著高于對照組（P＜0.05），愈傷第5天時AOS噴施處理的SPP和木質素細胞層厚度分別高出對照組22.70%和25.07%，第7天時AOS噴施處理的SPP和木質素細胞層厚度分別高出對照組59.43%和43.36%（P＜0.05）（圖2C、D）。上述結果表明，AOS采前噴施加速了SPP和木質素在果實傷口處的沉積。

圖2 AOS采前噴施對采后果實愈傷期間SPP和木質素沉積及相應細胞厚度的影響Fig. 2 Effect of preharvest AOS sprays on SPP and lignin deposition and resulting cell layer thickness in harvested muskmelons during wound healing

2.3 AOS采前噴施對采后果實愈傷期間傷口處苯丙烷代謝的影響

隨著愈傷時間的延長，AOS噴施處理和對照組果實傷口處的PAL活力不斷增加，AOS組同期PAL活力顯著高于對照組（P＜0.05），第3天時AOS噴施處理的PAL活力高出對照組43.15%（P＜0.05）（圖3A）。AOS組和對照組果實傷口處的總酚、類黃酮含量和木質素含量隨著愈傷時間的延長逐漸增加，AOS組顯著高于對照組（P＜0.05），第5天時AOS噴施處理的總酚、類黃酮含量和木質素含量分別高出對照組12.15%、16.55%和20.91%（P＜0.05）（圖3B～D）。上述結果表明，AOS采前噴施增強了采后果實的苯丙烷代謝。

圖3 AOS采前噴施對采后果實愈傷期間傷口處PAL活力（A）以及總酚（B）、類黃酮（C）和木質素（D）含量的影響Fig. 3 Effect of preharvest AOS sprays on PAL activity (A), and the contents of total phenols (B), flavonoids (C) and lignin (D) in harvested muskmelons during wound healing

2.4 AOS采前噴施對采后果實愈傷期間傷口處H2O2含量和POD活力的影響

隨著愈傷時間的延長，AOS噴施處理和對照組果實傷口處的H2O2含量先上升后下降，第5天達到峰值，AOS組顯著高于對照組（P＜0.05），第3天時AOS噴施處理的H2O2含量是對照組的1.37 倍（P＜0.05）（圖4A）。AOS組和對照組果實傷口處的POD活力隨著愈傷時間的延長先上升后下降，第5天達到峰值，AOS組顯著高于對照組（P＜0.05），第7天時AOS噴施處理的POD活力高出對照組34.34%（P＜0.05）（圖4B）。上述結果表明，AOS采前噴施提高了采后果實傷口處的H2O2含量和POD活力。

圖4 AOS采前噴施對采后果實愈傷期間傷口處H2O2含量（A）和POD活力（B）的影響Fig. 4 Effect of preharvest AOS sprays on H2O2 content (A) and POD activity (B) of harvested muskmelons during wound healing

2.5 質量損失率和病情指數(shù)與其他指標間的相關性

質量損失率和病情指數(shù)與其他指標的相關性分析結果如表1所示，質量損失率與SPP細胞層厚度、木質素細胞層厚度、PAL活力、總酚及類黃酮含量之間具有極顯著正相關性（P＜0.01），相關系數(shù)依次為0.960、0.989、0.988、0.996和0.993；與木質素含量和H2O2含量之間具有顯著正相關性（P＜0.05），相關系數(shù)依次為0.942和0.888。病情指數(shù)與木質素細胞層厚度、PAL活力和類黃酮含量之間具有極顯著的負相關性（P＜0.01），相關系數(shù)依次為-0.971、-0.981和-0.989；與SPP細胞層厚度、總酚含量和H2O2含量之間具有顯著負相關性（P＜0.05），相關系數(shù)依次為-0.946、-0.956和-0.911。上述結果表明，傷口處SPP和木質素的積累降低了果實愈傷期間的質量損失率和病情指數(shù)。

表1 質量損失率和病情指數(shù)與其他指標間的相關性Table 1 Correlation between mass loss and disease index and other indicators

3 討 論

苯丙烷代謝在果實愈傷過程中發(fā)揮著重要作用，既可為SPP和木質素的形成提供所需的單體，又可形成具有抗氧化和抗菌活性的酚類物質[26]。PAL是苯丙烷代謝的關鍵酶，參與苯丙烷代謝第一步反應，其可將L-苯丙氨酸脫氨轉化為反式肉桂酸[27]，后者在肉桂酸羥化酶的作用下生成p-香豆酸[28]，p-香豆酸在香豆酸-3-羥基化酶作用下經過羥基化和酯化生成咖啡酸，咖啡酸經兒茶酚氧位甲基轉移酶生成阿魏酸，阿魏酸首先羥化生成5-羥基阿魏酸，接著在5-羥基阿魏酸-O-甲基轉移酶作用下催化生成芥子酸[29]，這些酚酸是SPP聚合的重要單體[30]。在4-香豆酰-輔酶A連接酶的作用下，上述酚酸轉化為酚酸-CoA[31]，這些化合物再在肉桂酰輔酶A還原酶和肉桂醇脫氫酶的作用下生成木質素的底物芥子醇、松柏醇和肉桂醇[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，AOS采前噴施提高了果實傷口處的PAL活力，提高了總酚、類黃酮含量和木質素含量（圖3）。該結果與AOS處理提高柑橘PAL活力以及促進木質素合成的結果[13]類似。有研究表明，AOS可促進柑橘果實H2O2的形成，H2O2作為信號分子可激活PAL[14]。AOS還可誘導擬南芥水楊酸和茉莉酸的合成[33]，而水楊酸和茉莉酸作為植物激素可激活蘋果葉片的苯丙烷代謝[34]。因此，AOS可能通過調控H2O2以及水楊酸和茉莉酸的產生來激活苯丙烷代謝，至于AOS如何調控H2O2以及植物激素的合成尚有待進一步研究。

SPP和木質素是甜瓜果實愈傷封閉層的重要組成部分。SPP主要由阿魏酸、肉桂酸等酚酸以酯鍵和醚鍵相互連接而成[2]，木質素由肉桂醇、松柏醇和芥子醇通過醚鍵聚合而成[35]。SPP和木質素單體的聚合過程均需要H2O2和POD共同參與[36]。本研究觀察到，AOS噴施提高了采后甜瓜果實傷口處的H2O2含量和POD活力（圖4），該結果與AOS處理提高柑橘和冬棗的H2O2含量和POD活力結果[14,37]類似。愈傷中的H2O2主要通過NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）反應生成，NOX可通過給O2轉移電子產生，由于不穩(wěn)定，很快被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）歧化為H2O2[38]。有報道表明，AOS可上調黃瓜果實中SOD基因表達，促進H2O2積累[39]。AOS還可上調柑橘果實POD12和POD16基因表達，提高POD活力[13]。

AOS采前噴施加速了采后甜瓜果實傷口處SPP和木質素的沉積（圖2），沉積產生的物理屏障抑制了水分蒸騰和病原菌侵染，導致果實愈傷期間的質量損失率和病情指數(shù)相比對照組明顯降低（圖1）。此外，AOS還可提高病程相關蛋白基因的表達水平，從而增強果實抗病性[12]。因此，AOS采前噴施對采后果實愈傷期間質量損失率和病情指數(shù)的抑制，與加速果實傷口處SPP和木質素的沉積有關。

4 結 論

果實發(fā)育期AOS連續(xù)4 次噴施提高了采后甜瓜果實傷口處的PAL活力，促進了總酚、類黃酮、木質素的積累；噴施處理還提高了果實傷口處的H2O2含量和POD活力。苯丙烷代謝產物在H2O2和POD共同作用下氧化聚合形成SPP和木質素，并在傷口表面沉積，從而有效降低了損傷果實在愈傷期間質量損失率和病情指數(shù)，促進了采后甜瓜果實的愈傷。鑒于AOS廉價、安全、高效的特性，可作為果實促愈劑進行開發(fā)。