關于限制酶的考點例析

山東 孔德星 孫 茜

在近幾年的山東省高考試題中，“基因工程”一直是必考題目之一，試題中與限制酶相關的題目靈活多樣，難度較大。因此，筆者結合一些典型例題，對限制酶的考點進行了歸納整理，希望能夠提高學生的理解能力和解題能力，為高三學生的備考提供幫助。

一、限制酶的作用

在基因工程中，切割DNA分子的工具是限制酶，這類酶能夠識別并切割雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。DNA分子經限制酶切割產生的DNA片段末端，通常有兩種形式：黏性末端和平末端。切割并不是目的，目的是連接。因此，解題時要注意限制酶識別序列的特點。

【例1】關于如圖1所示黏性末端的說法，錯誤的是

( )

圖1

A.甲、乙、丙黏性末端是由不同限制酶作用產生的

B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，但甲、丙不能

C.DNA連接酶的作用位點是b處

D.切割產生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA片段

【答案】C

【解析】限制酶能識別并切割特定的核苷酸序列。據圖1并補充完整限制酶識別序列后可知，甲、乙、丙是由不同的限制酶切割產生的黏性末端，A正確。根據黏性末端的堿基序列可知，甲、乙單鏈部分堿基互補可形成重組DNA分子，甲、丙不能形成重組DNA分子，B正確。b是氫鍵，DNA連接酶的作用部位是磷酸二酯鍵，不是氫鍵，C錯誤。產生甲黏性末端的限制酶識別的序列是5′-GAATTC-3′。甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子的序列是5′-CAATTC-3′，由于限制酶具有特異性，因此切割產生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA片段，D正確。

【補充說明】切割不同的DNA片段但產生相同的黏性末端的一類限制酶稱為同尾酶。兩個同尾酶切割的DNA片段連接后，一般情況下，不能再被原來的限制酶識別。

二、限制酶選擇的“三不一定位”原則

1.不破壞

基因表達載體中包含啟動子、終止子、復制原點、目的基因和標記基因等組件。啟動子是RNA聚合酶識別并結合的位點，可以驅動轉錄；終止子用于終止轉錄；復制原點是DNA復制的特定起始位點；標記基因便于重組DNA的篩選。以上組件在目的基因的復制和表達中均具有重要的作用，均不能被破壞，因此酶切位點位于組件內部的限制酶都不能使用。當然基因表達載體中往往有多個標記基因，并非都不能破壞，要至少保留一個，以用于重組DNA的鑒定和篩選。

2.不自身環化

如果使用一種限制酶切割目的基因和載體，往往會出現自身黏性末端互補連接的情況，為了避免出現自身環化的現象，一般選擇兩種限制酶分別切割目的基因的上下游，產生不同的黏性末端。同時使用這兩種限制酶切割載體，以便目的基因和載體相連。

3.不反向連接

DNA的兩條鏈分別是模板鏈和非模板鏈，其中的脫氧核苷酸的排列順序不同，因此不能顛倒。目的基因和載體連接以后只有正確的連接順序才能保證目的基因的復制與表達。例如使用一種限制酶切割目的基因和載體，目的基因兩側就會形成相同的黏性末端，所以目的基因和載體就會有正向和反向連接的兩種情況。

【例2】圖2甲、乙中的箭頭表示三種限制性內切核酸酶的酶切位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯誤的是

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圖2

A.在構建重組質粒時，可用PstⅠ和HindⅢ切割質粒和外源DNA

B.在酶切過程中，不能破壞質粒中全部的標記基因

C.若只用PstⅠ處理質粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環化和反向連接

D.導入重組質粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養基中生長

【答案】D

【解析】在構建重組質粒時，需要選擇相同的限制酶切割外源基因和質粒，分析圖2甲和乙，質粒和外源基因中相同且不會破壞目的基因的限制酶是PstⅠ和HindⅢ，并且質粒上能夠保留一個完整的標記基因，A正確；在酶切過程中，不能破壞質粒中全部的標記基因，要保證切割后的質粒至少保留一個標記基因，以便進行篩選，B正確；若只用一種限制酶處理質粒和外源DNA分子片段，因為產生的黏性末端相同，故無法避免自身環化和反向連接，C正確；本題只能使用PstⅠ和HindⅢ切割，用PstⅠ切割后，氨芐青霉素抗性基因被破壞了，因此導入重組質粒的大腸桿菌不可以在含氨芐青霉素的培養基中生長，D錯誤。

4.“一定位”

基因工程中，所選用的限制酶酶切位點應位于啟動子和終止子之間；若是質粒上存在T-DNA，酶切位點應位于T-DNA中，從而有利于目的基因嵌入其中，隨質粒或T-DNA復制和表達。因此，還可以根據特殊的酶切位點選擇限制酶。

【例3】(2021年，山東卷，第25題節選)人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有BCL11A蛋白結合位點，該位點結合BCL11A蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖3所示。

圖3

(1)為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖3可知，在F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是________，在R末端添加的序列所對應的限制酶是________。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要________種酶。

【答案】(1)SalⅠEcoRⅠ 6

【解析】對于基因工程的題，一般要分析基因的位置，基因的上下游(因為上下游要添加引物)，還有基因的方向以及限制酶的識別序列。根據題干分析，從箭頭的方向以及終止子所在的位置可知，γ基因和熒光蛋白基因方向是相反的。限制酶MunⅠ與EcoRⅠ是同尾酶；限制酶XhoⅠ與SalⅠ是同尾酶，識別并切割后的黏性末端相同。要將調控序列和啟動子插入載體指導熒光蛋白基因表達，一定要將引物添加在F1的上游(左側)和R的上游(右側)。

在熒光蛋白基因上游進行切割有兩種限制酶的組合：限制酶MunⅠ與EcoRⅠ和限制酶MunⅠ與XhoⅠ，但由于限制酶MunⅠ與EcoRⅠ是同尾酶，會發生自身連接，因此不能使用。所以，切割熒光蛋白基因上游只能使用限制酶MunⅠ與XhoⅠ。根據限制酶選擇的“三不一定位”原則，不能直接使用限制酶MunⅠ與XhoⅠ切割引物，因此只能使用同尾酶，分別是限制酶EcoRⅠ和SalⅠ。限制酶EcoRⅠ識別的位點對應的是R的上游(右側)位置；限制酶SalⅠ識別的位點對應的是F1的上游(左側)。綜上所述，對載體使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，對擴增后的產物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ識別序列，然后在DNA連接酶的催化作用下，連接形成重組載體；產物擴增中需要使用Taq酶。因此，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要6種酶，分別是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA連接酶。

三、根據切割后電泳片段，推導酶切位點

1.電泳

DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。

2.推斷方法

(1)DNA分子為鏈狀。若限制酶切割后電泳出現兩條電泳條帶，則說明該DNA分子中含有一個限制酶的酶切位點；同理若限制酶切割后電泳出現三條電泳條帶，則說明該DNA分子中含有兩個限制酶的酶切位點，以此類推。

(2)DNA分子為環狀。若限制酶切割后電泳出現一條電泳條帶，則說明該DNA分子中含有一個限制酶的酶切位點；若限制酶切割后電泳出現兩條電泳條帶，則說明該DNA分子中含有兩個限制酶的酶切位點，以此類推。

【例4】(2022·山東菏澤)在生物DNA的測序工作中，需要將某些限制性內切核酸酶的限制位點在DNA上定位，使其成為DNA分子中的物理參照點，這項工作叫作“限制酶圖譜的構建”。假設有以下一項實驗：分別用限制酶HindⅢ、BamHⅠ以及兩者的混合物降解一個4 kb(1 kb=1 000堿基對)大小的線性DNA分子，并將降解產物分別進行凝膠電泳。在電場的作用下，降解產物分開，如圖4所示。據此分析，這兩種限制性核酸內切酶在該DNA分子上的限制位點數目是

( )

圖4

A.HindⅢ1個，BamHⅠ2個

B.HindⅢ2個，BamHⅠ3個

C.HindⅢ2個，BamHⅠ1個

D.HindⅢ2個，BamHⅠ2個

【答案】A

【解析】據圖4分析，限制酶HindⅢ將DNA切割為2段(2.8 kb和1.2 kb)，故限制酶HindⅢ有一個切點，BamHⅠ將DNA切割為3段(1.8 kb、1.3 kb、0.9 kb)，表明BamHⅠ有2個切點，分別在離該DNA一端0.9 kb處和2.2 kb處，同時用兩種酶切割，則限制酶HindⅢ將該DNA切割為2段(2.8 kb和1.2 kb)，BamHⅠ再將2.8 kb這段DNA切割為2段(1.8 kb和1.0 kb)，將1.2 kb切割為2段(0.9 kb和0.3 kb)。因此選A。

3.推斷酶切片段的長度

對限制酶切割結果的考查，除了考查酶切位點的數量以外，還會判斷酶切片段的長度。這一類題往往通過畫圖來幫助學生分析得出正確的結論。

【例5】用限制酶EcoRⅤ單獨切割某普通質粒，可產生14 kb(1 kb即1 000個堿基對)的長鏈，而同時用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ聯合切割該質粒，可得到三種長度的DNA片段，如圖5(其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一個黏性末端)。

圖5

若用MboⅠ限制酶單獨切割該普通質粒，則產生的DNA片段的長度為

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A.2.5和5.5 B.2.5和6

C.5.5和8 D.6和8

【答案】D

【解析】用限制酶EcoRⅤ單獨切割某普通質粒，可產生14 kb(1 kb即1 000個堿基對)的長鏈，說明質粒中含有1個EcoRⅤ切點；同時用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ聯合切割該質粒，通過畫圖分析，可得到三種長度的DNA片段，說明質粒中含有2個MboⅠ切點。若用MboⅠ限制酶單獨切割該普通質粒，則產生的DNA片段為2種，總長度為14 kb，因此選D。酶切位點分布可能如圖6。

圖6