地龍多肽舒緩修護功效評估研究

何海鷗，史林艷

（珠海伊斯佳科技股份有限公司，廣東珠海 519000）

地龍為鉅蚓科動物參環毛蚓 Pheretima aspergillum （E.Perrier）、通俗環毛蚓 P.vulgaris Chen、威廉環毛蚓 P.guillelmi （Michaelsen）或櫛盲環毛蚓P.pectinifera Michaelsen 的干燥體[1]。可入藥，該藥材在我國已有悠久的使用歷史，其性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經，具有清熱止痙、平肝熄風、通經活絡、平喘利尿的功效；用于治療高熱神昏、驚癇抽搐、關節痹痛、肺熱喘咳、尿少水腫、高血壓等癥[2]。地龍的化學成分主要包括：氨基酸類化合物、核苷類化合物、二肽類化合物、有機酸類化學物、無機元素、蛋白類化合物及其他類[3]。其有非常多的藥理作用：抗炎鎮痛、治療哮喘、化痰止咳、鎮靜催眠及抗驚厥、預防糖尿病腎臟疾病、促進創傷愈合、降脂等。其中抗炎鎮痛和促進創傷愈合的功效讓其可應用在舒緩類的化妝品中，在《已使用化妝品原料名稱目錄》（2021 版）中有參環毛蚓提取物，本文通過誘導人體皮膚紅斑模型法和開放使用法兩種評價方法，探究地龍多肽DHEPP舒緩和修護皮膚的功效。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

地龍多肽DH-EPP，INCI中文名：參環毛蚓提取物，疏松淡黃色粉末（重慶東寰科技提供）；十二烷基硫酸鈉（SLS，分析純99%）；10%乳酸溶液；精華A（不含地龍多肽DH-EPP），精華B（含0.5%地龍多肽DH-EPP）（精華A和B其他成分均相同，且不含其他舒緩修護功效成分）；皮膚經皮水分流失測試儀（Delfin）；皮膚膚色測試儀（Delfin）；皮膚分析儀（visia 7）；溫濕度記錄儀；斑試器，分析天平。

1.2 測試環境

溫度（21±1）℃，濕度40 %～ 60%。

1.3 實驗方法

1.3.1 誘導人體皮膚紅斑模型法

在封閉性的條件下，用3%十二烷基硫酸鈉（SLS）溶液斑貼作用于皮膚24h，待斑貼去除后，利用人工誘導皮膚紅斑反應。通過測量皮膚在誘導后及使用產品后不同的皮膚參數（如經表皮失水率和皮膚紅色素），評價產品舒緩修護功效。

1.3.1.1 研究對象

受試者納入應符合以下標準：18~60 歲的健康成年人；無嚴重慢性消耗性疾病（如哮喘、糖尿病等），無皮膚病變、炎癥、濕疹等；雙前臂屈側皮膚完好，沒有任何疤痕，損傷，膚色不均等影響評估因素；近一月內未曾使用激素類藥物及免疫抑制劑者；最近三個月受試部位未參加其他臨床試驗者；孕期或哺乳期的女性應排除在外；測試前簽署志愿者知情同意書。

1.3.1.2 誘導人體特應性皮炎模型

根據要求招募33名受試者，受試者應在測試環境中休息30min后再開展測試。在受試者雙前臂屈側處，根據隨機要求在左或右前臂屈側標記受試區域，受試面積不得少于3cm×3cm。受試區域根據隨機選擇分為對照組、測試組區域。將0.020~0.025mL的誘導物（質量分數為3%的SLS溶液）置于濾紙片，放入斑試器小室內。將加有誘導物的斑試器用低致敏膠帶貼敷于受試者的預設受試區，用手掌輕壓使之均勻地貼敷于皮膚上，持續24h[4]。在移除斑試器后的6h為皮膚紅斑誘導反應期，不進行任何處理。

1.3.1.3 指標測定

由專業研究員對受試者誘導受試部位的皮膚狀況進行詢問和檢查，最終納入31人，完成測試31人。

受試者按要求在各紅斑反應測試區使用產品，早晚各一次，連續使用測試產品10d，在使用產品后5d±1d、10d±1d對經皮失水量、皮膚紅區a*值進行回訪測試，并記錄。

1.3.2 人體開放使用法

通過乳酸刺痛測試篩選出皮膚不耐受人群，通過測量皮膚使用產品前及后不同的皮膚參數（經皮失水量和皮膚紅區面積），評價產品舒緩修護功效。

1.3.2.1 研究對象

受試者納入應符合以下標準：乳酸刺痛試驗篩選呈陽性者；受試者處于敏感肌的非發病期；顏面部皮膚完好，沒有任何疤痕，損傷，膚色不均等影響評估因素；其他基礎條件同紅斑模型法。

1.3.2.2 半主觀評價乳酸刺痛試驗

在測試環境下，將50μL 10%乳酸溶液涂抹于鼻唇溝，分別在涂抹后2.5min和5min時詢問受試者的自覺癥狀，按4分法進行評分（0分為沒有刺痛感，1分為輕度刺痛，2 分為中度刺痛，3 分為重度刺痛），并將兩次分數相加，總分≥3分者為乳酸刺痛反應陽性。納入乳酸刺痛試驗陽性受試者33人，最終完成測試31人（其中有2人因個人原因退出）。

1.3.2.3 指標測定

使用面部圖像分析儀對顏面部進行圖像采集分析皮膚紅區面積，利用皮膚探頭測量皮膚經皮失水量，并將測試數據記錄。受試者按要求半臉使用不同產品，樣品組（精華B）與對照組（精華A）隨機分布，早晚各一次，連續使用產品28d，在使用產品后14d±1d、28d±1d進行上述指標測試，并再次進行乳酸刺痛試驗。

1.4 統計分析

計算分析參數的初始值/其他測量時間點/其他組間的數值，使用專業統計軟件SPSS21.0進行分析。如數據呈正態分布，采用 t 檢驗或方差分析方法進行數據分析統計；如數據呈非正態分布，采用秩和檢驗方法進行統計；統計方法均采用雙尾檢驗，檢驗水平α=0.05。

2 結果與討論

2.1 誘導人體皮膚紅斑模型法

用3% SLS溶液誘導手臂內側皮膚紅斑，基于儀器測量經皮水失水量（TWEL）如表1所示。

表1 手臂經皮失水量（g·m-2·h-1）差異性分析

從上述數據可知，不管使用精華A或精華B，紅斑區的經皮失水量在第5d和第10d都顯著降低（P＜0.05），皮膚存在自身修護作用；使用精華B的部位經皮失水量顯著低于精華A，在第5d和第10d改善率分別達到49.19%（P＜0.001），57.38%（P＜0.05），在第10d的經皮失水量已恢復至建模前的狀況，說明添加了地龍多肽的精華B有更好的舒緩修護的功效。

用皮膚顏色測試儀測試代表紅區的皮膚a值，a值越小，說明紅區改善效果越明顯，測試結果如表2所示。

表2 手臂皮膚a值差異性分析

從上述數據可知，使用精華B的部位在第5d與建模6h的基值相比就表現出了非常顯著的改善（P＜0.001），精華A和精華B在使用第5d和第10d紅區效果改善均有顯著性差異，說明精華B有較好的改善皮膚紅區的效果。

2.2 人體開放使用法

通過產品使用前后半主觀評價乳酸刺痛試驗評分、皮膚經皮失水量和visia圖像分析皮膚紅區面積的變化情況來評估舒緩和修護效果，數據如表3所示。

由上述數據可知，從乳酸刺痛試驗評分、經皮失水量和皮膚紅區面積幾個指標來看，使用精華B 28d后與精華A相比，效果都有顯著性差異（P＜0.05），說明在人體開放使用法中，添加了地龍多肽的精華B對皮膚有更好的舒緩修護效果。

3 結論

研究表明，通過誘導人體皮膚紅斑模型法和開放使用法評估添加了0.5%地龍多肽DH-EPP的精華對皮膚舒緩修護的功效，在兩種人體功效評價方法中，該精華與對照組相比，都表現了顯著性的舒緩修護效果，且兩種方法測試的趨勢一致。

表3 產品使用前后皮膚各測量指標的差異性分析

4 討論

中藥地龍資源豐富，其蛋白多肽類成分含量高、毒性低，具有多方面的藥理作用，國內外學者對地龍蛋白多肽類成分的研究也日益深入和廣泛，并開發出多種地龍蛋白多肽類產品，如地龍活性蛋白膠囊、地龍蛋白溶血栓膠囊、蚓激酶腸溶膠囊、多肽地龍蛋白等[4]。地龍多肽DH-EPP可溶解在水中，采用了特殊的酶解工藝，低溫分離制備，多肽分子量在5000道爾頓以下，具有高生物活性。本文通過誘導人體皮膚紅斑模型法和開放使用法對比評估添加了0.5%地龍多肽DH-EPP的精華B和不添加地龍多肽的精華A對皮膚的舒緩修護效果，在兩種測試方法中，測試的結果趨勢一致，說明地龍多肽DH-EPP有比較好的舒緩修護效果，為進一步擴展地龍多肽在化妝品中的應用提供了基礎。