根系分泌物在‘熱研2號’柱花草與鬼針草生長早期種間干擾中的作用

王俐媛，王 堅，李雪楓*, 趙元辰，許 超

(1.熱帶特色林木花卉遺傳與種質創新教育部重點實驗室/海南大學林學院，海南 海口 570228；2.海南大學動物科技學院，海南 海口 570228)

柱花草(Stylosanthesspp.)又名筆花豆、巴西苜蓿，原產中南美洲及加勒比海地區[1]。柱花草作為放牧刈割兼用的優質牧草，選育出的多個品種現已在世界熱帶和亞熱帶地區推廣利用[2-3]。其中，‘熱研2號’柱花草(S.guianensisSw.‘Reyan No.2’)在海南、廣東、廣西、臺灣、福建、云南、四川等地區均可種植，是最適合我國熱帶、南亞熱帶種植的豆科牧草之一，適用于改良天然草地、刈割利用或曬制干草粉，供作豬、禽的配合飼料，現成為柱花草的當家品種[3-4]。為建立高產刈割草地，‘熱研2號’柱花草通常采用種子繁殖，播種期2～5月，種子田播種量為6.0～7.5 kg·hm-2，條播，行距40～50 cm[5]。柱花草在幼苗期生長緩慢，且條播時預留的生長空間較大，而此時雜草卻因為水熱條件適宜而生長迅速，與柱花草幼苗爭肥、爭水、爭光，侵占幼苗生長空間，危害柱花草幼苗，若管理不當，可能會導致柱花草草產量顯著降低[6]。

菊科(Asteraceae)一年生雜草鬼針草(BidenspilosaL.)因具有靈活的交配特性，既可以異交授粉，又能自交結實，結實率高，單個花序的結實率就高達77.54%[7-8]，種子上的芒刺利于其附著其它物體廣泛傳播，萌發率也高達80%以上[7]，還能夠通過較強的化感作用增強其入侵為害能力[9]，是海南省旱生環境發生的優勢雜草之一[10]，不但在海南各地的農業生態系統中隨處可見，也是柱花草草地入侵為害的代表性雜草之一。目前，學者們已經研究了用南方菟絲子寄生[11]、水稻秸稈-薄膜連續疊加覆蓋[12]等農業生態方法和噴施廣譜性或滅生性除草劑的化學方法[8]來有效控制鬼針草的蔓延，但這些防控方法難以直接用于柱花草草地中鬼針草的防控，易危害柱花草的生長。因此，需要摸清柱花草與鬼針草的種間相互作用機制，為探索柱花草草地新的、安全高效的鬼針草防控方法提供理論依據。

植物種間相互作用包括競爭作用和化感作用[13]，而根系分泌物在植物與植物根系相互作用中發揮著關鍵作用[14-15]。鄰近生長的植物彼此的根系均會不斷地向根際環境釋放出多種化合物，包括氨基酸、糖類、有機酸、維生素、核苷酸以及各種其他次級代謝物和粘液、蛋白質等許多其他高分子量物質[14,16]。這些根系分泌物既可以改變土壤的化學和物理性質、調節土壤微生物群落結構[17]，也可以作為信號物質促使植物進行相應生長調節響應[18]。已有的研究表明：在植株體無任何接觸情況下，柱花草根系分泌物對鬼針草幼苗的生長有相對較弱的抑制效應[19]，而鬼針草的根系分泌物在決定鬼針草與其他植物的相關關系中也起著重要的作用[8,20]，但鬼針草根系分泌物對柱花草的化感效應尚未見報道，柱花草與鬼針草的種間相互作用情況也尚不明確。因此，本研究首先采用水培法來估測無任何株體接觸條件下，柱花草和鬼針草各自的根系分泌物對彼此幼苗生長的化感效應差異，然后用盆栽法分析二者在不同的伴生條件下，根系接觸和根系分泌物交流程度對柱花草與鬼針草的種間干擾的影響情況，以期揭示根系分泌物在二者種間關系中的作用，為人工草地開發科學合理的雜草農業生態管理策略提供理論參考，為鬼針草入侵生境的生態修復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘熱研2號’柱花草的種子由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家熱帶牧草中期備份庫提供。鬼針草種子采集自海南大學海甸校區及其周邊地區的鬼針草成熟個體，自然風干后，保存于陰涼干燥處備用。

營養液購自福州飛凈生物科技有限公司，霍格蘭營養液成分為：硝酸鉀607.00 mg·L-1，磷酸二氫鈉115.00 mg·L-1，硫酸鎂493.00 mg·L-1，EDTA鐵鈉鹽20.00 mg·L-1，硫酸亞鐵2.86 mg·L-1，硼砂4.50 mg·L-1，硫酸錳2.13 mg·L-1，硫酸銅0.05 mg·L-1，硫酸鋅0.22 mg·L-1，硫酸銨0.02 mg·L-1。取本品0.63 g，另取鈣鹽0.47 g，加熱溶解于1000 mL蒸餾水中，配制成1/2霍格蘭營養液備用。

盆栽試驗所用土壤按V(磚紅壤)∶V(營養土)=1∶1配制。磚紅壤采自海南大學儋州校區試驗基地，土壤理化性質為有機質15.84 g·kg-1，堿解氮124.46 mg·kg-1，速效鉀59.93 mg·kg-1，有效磷87.65 mg·kg-1，鹽基飽和度17.82%，pH=5.90。營養土購自內蒙古巴彥淖爾市躍羊生物科技有限責任公司海南東方市代理銷售處，原料選自內蒙古天然草原羊糞，有機質含量≥45%，氮、磷、鉀含量≥5%。

1.2 試驗方法

1.2.1種子催芽處理 柱花草的種子用75%的酒精表面消毒5 min，沖洗干凈后用80℃水浴處理3～5 min，自然晾干[21]，置于鋪有雙層濾紙、直徑9 cm的培養皿中催芽；鬼針草種子消毒處理、晾干后，直接選取均一飽滿的種子置于同樣規格的培養皿中。所有培養皿均上蓋置于25℃黑暗條件下培養至種子萌發，中途每天開蓋添加1 mL去離子水。

1.2.2水培生長試驗 參考魏嘉禾和陳斌[22]的研究方法，采用營養液水培法分別收集柱花草和鬼針草的根系分泌物。挑選催芽處理后同期露白的柱花草和鬼針草的種子(胚根突破種皮0.5～1 cm)分別移植至盛有1/2 Hoagland營養液(pH=5.80)、液面覆雙層脫脂紗布的15 mL玻璃管，每管1株植株；玻璃管放入上蓋有20個孔洞的培養箱中，每孔1個玻璃管，使浸入營養液的根系避光生長。培養箱置于25℃/14 h黑暗、30℃/10 h光照、相對濕度75%的人工氣候箱內培養。每天定時向玻璃管內補充營養液，使液面保持在恒定水平。共培養10 d，使每個玻璃管內的液體中均含有所生長植株分泌的根系分泌物。

待各植株幼苗在1/2 Hoagland’s營養液中生長10 d后，選取長勢一致的柱花草和鬼針草植株，將鬼針草幼苗與柱花草的幼苗對調后繼續培養，即鬼針草幼苗置換至原本生長柱花草的玻璃管、而柱花草幼苗置換至鬼針草幼苗原本生長的玻璃管，每株對應一個試管；以柱花草幼苗和鬼針草幼苗分別移植到原本生長同種植物的玻璃管中繼續培養為對照。每個處理設4個重復。生長7天后，測量每株幼苗的苗高、根長，計數其側根數，然后用吸水紙吸干各植株表面的水分，用感量0.1 mg天平測定其芽鮮重和根鮮重。

1.2.3盆栽生長試驗 參考汪雪等[23]的試驗方法，將催芽處理后的柱花草幼苗與鬼針草幼苗等距離相鄰盆栽伴生，地上部枝條間可自然接觸，地上部根系間設置3種接觸方式，使植株間的生長受不同程度的彼此間根系分泌物的影響。分別為：①根系自由接觸，花盆內無分隔物，兩種植物根系分泌物可自由交換；②根系不完全接觸，花盆內用30 μm尼龍網袋分隔，兩種植物根系間不能直接接觸，但根系分泌物可以進行交換；③根系無接觸，花盆內用塑料袋分隔，兩種植物根系完全不接觸，根系分泌物不能相互交換。以3種根系接觸方式下內外圈均種植同一種植物為對照。在花盆左右兩側分別穴播2～3粒催芽露白的柱花草和鬼針草種子，出苗生長至2～3葉間苗，每穴保留1株幼苗，每盆柱花草和鬼針草的株數比為1∶1。第30 d，計數每株植物分枝數，測量株高后，小心用蒸餾水清洗并分開2種植物的根系，用根系掃描儀測量測總根長、根體積和側根數；再將每株植物根、莖、葉分開，分別置于105℃鼓風干燥箱殺青30 min后70℃烘干至恒重，稱取各部分干重。

1.3 數據處理與分析

水培生長試驗中，為便于分析柱花草與鬼針草的生長情況，各指標采用相對值(相對指標值(%)=處理指標/對照指標)表示，并利用化感效應指數(Allelopathic response index,RI)、化感綜合效應指數(Synthetical effect of allelopathy,SE)[24]分析柱花草與鬼針草根系分泌物對彼此幼苗生長的化感作用；伴生生長試驗中，采用相對產量(Relative yield,RY)、相對產量總和(Relative yield total,RYT)以及競爭平衡指數(Competitive balance index,CB)[4]分析柱花草和鬼針草在混種后的競爭情況。計算公式如下：

化感效應指數(RI)=

1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T≥C)

(1)

化感綜合效應指數(SE)=

(RIH+RIR+RIL+RIRW+RIHW+RITW)/6

(2)

式中T為處理值，CK為對照值，RI>0表示存在促進作用，RI<0表示存在抑制作用。RIH，RIR，RIL，RIRW，RIHW，RITW分別為同一處理下的苗高、根長、側根數、根鮮重、苗鮮重、總鮮重的化感效應指數。SE>0表示化感綜合效應為促進，SE<0表示化感綜合效應為抑制，SE的絕對值越大表示化感綜合效應越強。

柱花草相對產量(RYS)=YSB/YS

鬼針草相對產量(RYB)=YBS/YB

(3)

式中YSB為柱花草與鬼針草混種時柱花草的單株產量，YBS為柱花草與鬼針草混種時鬼針草的單株產量，YS，YB分別為柱花草、鬼針草在單種時的單株產量，RY<1，說明植株種內競爭小于種間競爭，RY=1，說明種內競爭等于種間競爭，RY>1，說明種內競爭大于種間競爭。

相對產量總和(RYT)=(RYS+RYB)/2

(4)

其中：RYT<1，說明柱花草與鬼針草間具有競爭作用，RYT=1，說明柱花草與鬼針草需要相同資源，可以通過競爭將一種排除出去，RYT>1，說明柱花草與鬼針草間無競爭作用。

競爭平衡指數(CB)=ln(RYS/RYB)

(5)

其中：CB<0，說明柱花草的競爭能力比鬼針草弱，CB=0，說明柱花草與鬼針草的競爭能力相等，CB>0，說明柱花草的競爭能力比鬼針草強，CB值越大，競爭能力越強。

采用SPSS 21.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)對數據進行統計分析。柱花草和鬼針草幼苗在彼此根系分泌物處理下的各生長指標與對照(自身根系分泌物處理)間的差異均采用獨立樣本T檢驗(Independent-Samples T，Test)進行顯著性分析(P=0.05)。3種根系接觸方式下柱花草和鬼針草各生長指標、競爭指標間的差異均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan法多重比較(P=0.05)。所有數值均表示為“平均值±標準差”。用GraphPad Prism 8(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)進行作圖。

2 結果與分析

2.1 水培條件下柱花草和鬼針草的根系分泌物對彼此幼苗生長的影響

鬼針草根系分泌物處理下，柱花草幼苗的根長、側根數均比在自我根系分泌物處理中增加(表1)，其中，柱花草幼苗的根長增加了23.82%(P<0.05)，側根數增加了166.67%(P<0.05)；柱花草根系分泌物處理下，鬼針草幼苗的苗高、根長比在自我根系分泌物處理中降低，其中根長降低了28.14%(P<0.05)，而鬼針草幼苗的側根數比在自我根系分泌物處理中增加。兩兩比較顯示，在彼此根系分泌物影響下，柱花草的根長、側根數均顯著高于鬼針草(P<0.05，表1)。鬼針草根系分泌物處理下，柱花草幼苗的根鮮重、苗鮮重、總鮮重均降低，根冠比增加，但與自我根系分泌物處理均無顯著差異；柱花草根系分泌物處理下，鬼針草幼苗的根鮮重和根冠比分別比自我根系分泌物處理增加了24.36%，65.71%(P<0.05)，而鬼針草幼苗的苗鮮重、總鮮重均受到抑制，但差異不顯著。兩兩比較顯示，彼此根系分泌物影響下，各生物量指標(根鮮重、苗鮮重、總鮮重)在柱花草與鬼針草間均無顯著差異(表1)。

鬼針草根系分泌物對柱花草的苗高、根鮮重、苗鮮重和總鮮重均有化感抑制效應，而根長和側根數表現出化感促進作用，且鬼針草根系分泌物對柱花草的化感綜合效應為促進；柱花草根系分泌物影響下，除側根數和根鮮重外，鬼針草的各生長指標均表現為化感抑制效應，其化感綜合效應指數值為-0.08(表1)。

表1 對方根系分泌物影響下柱花草和鬼針草幼苗生長的變化

2.2 土培條件下根系分泌物對柱花草和鬼針草相互作用的影響

2.2.1不同根系接觸方式下柱花草與鬼針草伸長生長差異 與根系自由接觸相比，根系不完全接觸和無接觸方式下柱花草和鬼針草的根長顯著增加(P<0.05)，且根系無接觸時的根長均最大，分別為14.29 cm，28.51 cm(圖1A)。柱花草在根系無接觸下的苗高比自由接觸和不完全接觸顯著增加(P<0.05)，而鬼針草的苗高在3種接觸方式間無顯著差異(圖1B)。柱花草和鬼針草的根體積均在不完全接觸下達到最大值，分別比自由接觸和無接觸增加了190.00%，117.50%和271.43%，85.71%(P<0.05，圖1C)。與根系自由接觸相比，不完全接觸和無接觸方式下柱花草和鬼針草的分枝數均增加，且在根系無接觸下柱花草的分枝數增加了59.26%(P<0.05)，在不完全接觸和無接觸下鬼針草的分枝數增加了193.33%，186.67%(P<0.05，圖1D)。

圖1 不同根系接觸方式下柱花草和鬼針草的根長(A)、苗高(B)、根體積(C)和分枝數(D)的變化

2.2.2不同根系接觸方式下柱花草與鬼針草生物量積累與分配的差異 與根系自由接觸相比，柱花草的根生物量、莖生物量、葉生物量在不完全接觸下分別顯著增加了109.38%，97.56%，97.32%，在根系無接觸下分別顯著增加了275.00%，287.80%，177.68%，3種處理間差異顯著(P<0.05，圖2A，圖2B，圖2C)。與根系自由接觸相比，鬼針草的根生物量、莖生物量、葉生物量在不完全接觸方式下分別增加了647.50%，764.91%，744.33%(P<0.05)，在無接觸方式下分別增加了615.38%，785.95%，646.39%(P<0.05，圖2A，圖2B，圖2C)。但柱花草和鬼針草的根冠比在3種根系接觸方式間均無顯著差異(圖2D)。

圖2 不同根系接觸方式下柱花草和鬼針草的根生物量(A)、莖生物量(B)、葉生物量(C)、根冠比(D)的變化

2.2.3不同根系接觸方式下柱花草與鬼針草競爭效應的差異 柱花草相對產量(RYS)、鬼針草相對產量(RYB)以及競爭平衡指數(CB)在不同根系接觸方式下具有顯著差異(P<0.05，表2)。根系不完全接觸和無接觸的RYS均顯著大于1(P<0.05)，而自由接觸的RYS顯著小于1(P<0.05)，且三者間的差異顯著(P<0.05)。根系自由接觸的RYB顯著小于1，與RYB均大于1的根系無接觸和不完全接觸方式相比差異顯著(P<0.05)。RYT在3種根系接觸方式下均無顯著差異，但僅根系無接觸下柱花草與鬼針草間無競爭作用(RYT>1)。柱花草的CB在不完全接觸中顯著大于0，在自由接觸中CB顯著小于0，3種處理間差異顯著(P<0.05)。

表2 不同根系接觸方式下柱花草與鬼針草的競爭指標

3 討論

自然環境條件下多種因素共同作用，影響植物之間的相互關系，不但使作物和雜草間的種間關系更加復雜、不可預測和高度可變[25]，也使根系分泌物在植物生長中的作用難以明確[26]。本文通過營養液水培試驗，分別將柱花草和鬼針草幼苗的根系暴露在之前生長過對方植株的液體介質中，使幼苗彼此之間植株體不直接接觸，但其生長受原先植株的根系分泌物的影響，探究根系分泌物對彼此的相互作用。研究結果發現，與在自我根系分泌物中生長相比，鬼針草根系分泌物影響下柱花草幼苗的根長和側根數顯著增加，柱花草根系分泌物影響下鬼針草幼苗的根鮮重和根冠比顯著增加，而兩者的苗高、苗鮮重和總鮮重均減少，說明即使在土壤生物和非生物因子受到控制、養分資源充足、植物根系間的物理作用被消除的情況下，植株生長也會受到根系分泌物的影響。這與Biedrzycki等[27]、Yang等[28]將擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh)和水稻(OryzasativaL.)暴露在不同根系分泌物中生長獲得的結果一致。前人研究指出，植物通過根系分泌物識別鄰居的存在后能促進自身根系的生長，從而使其獲得較高的競爭能力[29]。因此本研究中柱花草和鬼針草的地下部形態均顯著變化的原因可能是識別到異種植物根系分泌物后受體植物為提高競爭力作出的響應。鬼針草根系分泌物對柱花草幼苗的化感綜合效應為促進，而柱花草根系分泌物對鬼針草幼苗的化感綜合效應為抑制，說明無其他因素影響下柱花草能利用根系分泌物抑制鬼針草的生長，在檢測到鬼針草根系分泌物時自身生長特別是根系生長增強。

面臨資源競爭、雜草危害等生存壓力時，栽培植物能夠通過根系分泌物識別鄰居植物的身份，調整自身的根系生長模式及表型可塑性，在與相鄰植物的競爭中獲得生存優勢[17,30]。為探究根系分泌物對栽培牧草與雜草在實際生長競爭中種間關系的具體作用，本研究在考慮環境、化感作用等因素的基礎上利用3種根系接觸方式探究了不同根系接觸和根系分泌物交流程度對柱花草與鬼針草的早期種間相互作用的影響。根系間完全無接觸后，柱花草和鬼針草的根長、分枝數、各部分生物量均顯著高于根系自由接觸，且二者的相對產量總和為1.10，說明柱花草與鬼針草間的相互干擾主要取決于根系接觸和根系分泌物交流，與地上部的交流和接觸程度并無緊密關聯。根系間僅根系分泌物可以自由交流時，柱花草和鬼針草的根長、根體積、各部分生物量均顯著高于根系自由接觸，這一試驗結果不但從側面佐證了張淞著[31]關于植物根系對資源的競爭過程主要通過根系空間的重疊達到這一結論，也說明此時柱花草和鬼針草的種間相互作用主要是根系分泌物介導的化感作用；此時柱花草的競爭平衡指數顯著大于0，說明柱花草的生長占優勢，這與水培試驗結果相一致，也再次佐證了根系分泌物在植物相互作用中發揮關鍵作用[32]。Yang等[30]研究發現，水稻和雜草的根系間僅根系分泌物可以自由交流時，水稻根系分泌的化感物質含量比直接接觸時顯著增加，對稗(Echinochloacrusgalli(Linn.)Beauv.)、鱧腸(Ecliptaprostrata(Linn.)L.)和千金子(Leptochloachinesis(Linn.)Nees)等雜草的化感抑制作用顯著增強；Khanh等[33]已經證明柱花草是具有強烈化感作用的植物之一，其根系中水楊酸、總酚、類黃酮等次生代謝產物豐富[33-34]，據此我們推測，根系間僅根系分泌物自由交流時柱花草根系分泌的抑制鬼針草生長的化感物質也可能增多，需要進一步試驗驗證。

根系間自由接觸時，柱花草的競爭平衡指數顯著小于0，柱花草的生物量分配策略無顯著變化，而鬼針草的生長占優勢，向地下部的生物量分配增大，結合水培試驗鬼針草根系分泌物對柱花草的化感作用相對較弱的結果，說明此時牧草與雜草的種間關系是資源競爭和化感作用共同作用的結果[35-36]，但柱花草與鬼針草種間關系中起主要作用的是種間競爭，對地下空間和養分的競爭能力增強使鬼針草在種間干擾中占優勢，根系間不能自由接觸打破了二者間的化學適應和根系相互作用的平衡，柱花草通過合成和釋放根系分泌物的方式調節其與鬼針草的競爭關系，以響應根系間相互作用的改變。因此根系間通過根系分泌物發生的化學作用在柱花草與鬼針草種間關系中發揮著重要作用。

4 結論

通過水培和3種根系接觸方式的盆栽生長試驗，我們發現‘熱研2號’柱花草與鬼針草的種間關系是競爭作用和化感作用共同作用的結果，種間相互作用主要發生在根系，根系分泌物在二者種間關系中起關鍵調控作用。其中，柱花草的種間干擾主要體現在通過根系釋放的分泌物對鬼針草的化感抑制方面，且這種干擾作用在根系不直接接觸狀態下能夠增強，而鬼針草通過加大地下生物量分配這一策略來抵御柱花草對其的化感干擾，從而增強其對資源的競爭能力。柱花草種植與管理過程中，在密切關注柱花草與雜草的土壤養分和水分競爭情況的同時，還要關注根系分泌物介導的化感作用，通過科學利用化感抑制作用來提高牧草產量和質量，實現雜草可持續防控。