達托利司抑制替莫唑胺耐藥惡性膠質瘤細胞增殖的機制研究

彭瀟 饒杰 吳慧華 項已桉

惡性膠質瘤是常見的原發性顱內腫瘤，患者預后不良，中位生存期僅14.6個月，3年生存率僅為10%[1]。外科手術聯合術后同步放化療是惡性膠質瘤的標準治療方案。替莫唑胺（temozolomide,TMZ）是惡性膠質瘤常用的化療藥物，但隨著化療進行，大部分患者最終會對TMZ耐藥[2]。TMZ的耐藥機制復雜，是不同機制相互作用的結果。除了DNA損傷修復，腫瘤微環境重塑、表觀遺傳學改變、信號通路持續活化等均可導致惡性膠質瘤細胞對TMZ耐藥[2-3]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）及其突變體在惡性膠質瘤組織和細胞中呈異常高表達，可促進惡性膠質瘤細胞增殖、遷移和耐藥[4]。EGFR介導的惡性膠質瘤耐藥與其持續激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）信號通路有關[5]。達托利司（dactolisib,DAC）是一種能夠干擾PI3K和哺乳動物雷帕霉素靶點復合物活性的小分子抑制劑，研究表明DAC能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖[6-8]，但對TMZ耐藥的影響及機制尚未完全明確。本研究探討DAC抑制TMZ耐藥惡性膠質瘤細胞增殖的機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 DAC（純度：＞98%，分子量：400.4648，批號：S117968）購自上海阿拉丁公司，杜爾伯科改良伊格爾培養基、青霉素-鏈霉素雙抗、FBS、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，EGFR（批號：ab52894）、B細胞淋巴瘤（B cell lymphoma 2,Bcl-2，批號：ab241548）、切割半胱氨酸蛋白酶 3（Cleaved-Caspase 3，批號：ab214430）和β-actin（批號：ab6276）抗體均購自上海Abcam公司。細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒（批號：C2015S）、赫斯特染料（批號：C1011）購自上海碧云天生物技術有限公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，Prime Script RT Master Mix試劑盒（批號：RR36A）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（批號：RR820A）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。U251細胞購自中國科學院細胞庫。本研究經醫院醫學倫理委員會批準[批準文號：科研倫審（2020）第（232）號]。

1.2 方法

1.2.1 耐藥細胞模型的建立 采用濃度梯度遞增法，將1×105個U251細胞接種于含有10%FBS的杜爾伯科改良伊格爾培養基，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養箱中培養，細胞貼壁后更換含有1 μmol/L TMZ的培養基，24 h后更換無TMZ培養基繼續培養，待細胞恢復生長且狀態良好后，重復上述操作繼續增加TMZ藥物濃度，直至細胞能在含有10 μmol/L TMZ的培養基正常生長時，停止誘導，獲得穩定耐藥細胞株，即TMZ耐藥U251細胞（U251R）。

1.2.2 細胞分組與轉染 將U251R細胞接種于無雙抗、無血清培養基，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養箱中培養；待細胞融合度為60%～80%時，將U251R細胞分為DAC組、DAC干預的EGFR低表達組（KD組）、DAC干預的EGFR過表達組（OE組）和對照組；DAC組、KD組、OE組分別用陰性對照載體、EGFRKD載體、EGFR-OE載體轉染48 h后，加入DAC；對照組為未經任何干預的U251R細胞。經上述處理后，將4組細胞置于培養箱內繼續培養48 h。

1.2.3 細胞死亡比例測定 采用鈣黃綠素和碘化丙啶雙染色法，用1 ml PBS洗滌4組細胞3次后，按照細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒說明書，加入1 ml含有鈣黃綠素和碘化丙啶的工作液，室溫下孵育30 min。測定細胞死亡比例，并用德國徠卡DMi8熒光顯微鏡觀察細胞死亡情況。

1.2.4 細胞凋亡比例測定 采用赫斯特染色法。用1ml PBS洗滌4組細胞3次后，加入1 ml含有赫斯特染料的工作液，置于室溫下孵育30 min。測定細胞凋亡比例，并用德國徠卡DMi8熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。

1.2.5 EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平檢測 采用Western blot法，用1 ml PBS洗滌4組細胞3次后，每孔加入150 μl細胞裂解液，冰上裂解15 min，收集細胞裂解液，置于4℃離心機，12 000r/min，離心15 min，收集上清液進行蛋白定量。將20 μg總蛋白加入聚丙烯酰胺梯度凝膠進行電泳分離后，用全濕轉膜法轉移蛋白至聚偏氟乙烯膜，隨后用3%脫脂奶粉封閉1 h，加入適量比例的EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3抗體，置于4℃冰箱過夜。用洗滌液洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋比例為1∶20 000）室溫下孵育2 h；再次洗膜后，用增強化學發光法顯影，采用Image J分析軟件對蛋白條帶進行半定量分析，比較4組細胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平。

1.2.6 EGFR mRNA相對表達水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法，用1 ml PBS洗滌4組細胞3次后，加入1 ml Trizol試劑，提取總RNA。按照Prime Script RT Master Mix試劑盒說明書合成cDNA，用ABI 7500 PCR儀進行實時熒光定量PCR。EGFR的引物系列為：上游 5'-GCCCTCTGGAGCACCTCTACT-3'，下游5'-CATCTTGCACTGTTTGAGGTTGTAC-3'；GAPDH作為內參，引物系列為:上游5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'，下 游 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。應用2-ΔΔCt法計算EGFR mRNA相對表達水平，比較4組細胞EGFR mRNA相對表達水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組細胞死亡比例比較 4組細胞死亡比例比較，差異有統計學意義（F=58.48，P＜0.01）。DAC組和KD組的細胞死亡比例為（53.11±7.96）%和（61.98±9.10）%，均高于對照組的（7.41±4.53）%，OE組細胞死亡比例為（6.70±3.22）%，低于DAC組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。顯微鏡下可見死細胞被碘化丙啶染色，呈紅色，活細胞被鈣黃綠素染色，呈綠色，見圖1（插頁）。

2.2 4組細胞凋亡比例比較 4組細胞凋亡比例比較，差異有統計學意義（F=12.67，P＜0.01）。DAC組、KD組細胞凋亡比例為（15.23±1.56）%和（18.36±5.96）%，均高于對照組的（2.96±1.54）%，OE組細胞凋亡比例為（1.63±1.30%），低于DAC組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。顯微鏡下可見凋亡的細胞核被赫斯特染料致密濃染，顯微鏡下呈亮藍色，見圖2（插頁）。

2.3 4組細胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平比較 4組細胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。DAC組和KD組細胞EGFR、Bcl-2蛋白表達水平均低于對照組，Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。OE組細胞EGFR、Bcl-2蛋白表達水平高于DAC組，Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平低于DAC組，差異有統計學意義（均P＜0.05），見表1。4組細胞EGFR、Cleaved-Caspase 3和Bcl-2蛋白表達水平的電泳圖見圖3。

圖3 4組細胞EGFR、Cleaved-Caspase 3和Bcl-2蛋白表達的電泳圖（a：EGFR蛋白表達的電泳圖，b：Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達的電泳圖）

表1 4組細胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase3蛋白表達水平比較

2.4 4組細胞EGFR mRNA相對表達水平比較 4組細胞EGFR mRNA相對表達水平比較，差異均有統計學意義（F=434.80，P＜0.01）。DAC組、KD組細胞EGFR mRNA相對表達水平為0.22±0.05和0.12±0.04，低于對照組的1.00±0.03，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；OE組細胞EGFR mRNA相對表達水平為2.40±0.16，高于DAC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

DAC是一種咪唑喹啉衍生物，可有效地抑制細胞增殖，對腫瘤生長、轉移有抑制作用，常用于輔助增加抗癌藥物的靈敏度[9]。近年來，報道稱DAC能誘發化療藥物耐藥細胞死亡，還能抑制酪氨酸受體抑制劑耐藥腫瘤細胞增殖[6，10-11]。Durrant等[6]發現 DAC 能逆轉卵巢癌和胰腺癌細胞阿霉素耐藥性。Yu等[11]研究表明DAC可誘發奧沙利鉑耐藥結直腸癌細胞死亡；Sano等[10]證實DAC能抑制埃羅替尼耐藥肺癌細胞增殖。本研究結果顯示，DAC組和KD組的細胞死亡比例高于對照組，差異均有統計學意義，與Yu等[9]結果一致，說明DAC能夠誘發U251R細胞死亡，可用于緩解TMZ耐藥。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，激活細胞凋亡途徑是DAC發揮抗腫瘤活性重要機制之一。研究發現，DAC干預后Bcl-2蛋白表達水平降低，細胞凋亡比例增加，但這種效應可被細胞凋亡抑制劑阻斷[12]。DAC還可損害細胞線粒體功能，增加細胞內活性氧含量，誘發細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，DAC組和KD組的細胞凋亡比例、Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平均高于對照組，DAC組、KD組細胞Bcl-2蛋白表達水平低于對照組，差異均有統計學意義。由此說明，DAC能夠打破凋亡相關蛋白之間的平衡關系，誘發U251R細胞凋亡，與Zhu等[14]的研究結果一致。

EGFR是一種酪氨酸激酶型受體，與配體結合后可發生構象變化，暴露磷酸化位點，發生自身磷酸化。隨后，磷酸化的EGFR能夠募集并激活PI3K，從而激活蛋白激酶B和哺乳動物雷帕霉素靶點復合物，進而調節細胞代謝、存活，抵抗藥物損傷[15-17]。研究表明TMZ耐藥的細胞中，EGFR磷酸化水平增加，能持續激活PI3K-蛋白激酶B信號通路[5]。報道稱PI3K或蛋白激酶B抑制劑能夠抑制EGFR及其突變體表達，緩解EGFR抑制劑耐藥[18]。也有報道稱哺乳動物雷帕霉素靶點復合物抑制劑與TMZ聯合應用能夠發揮協同抗惡性膠質瘤的作用[19]。

本研究中DAC組細胞EGFR蛋白表達水平和mRNA相對表達水平低于對照組，差異有統計學意義，與Wu等[8]結果一致。OE組細胞死亡比例、細胞凋亡比例低于DAC組，差異有統計學意義，由此說明DAC能夠通過降低EGFR表達，緩解TMZ耐藥，但EGFR持續過表達能夠阻斷DAC誘導U251R細胞死亡和凋亡。EGFR藥理學抑制劑可作為增敏劑用于提高TMZ抗惡性膠質瘤靈敏度，為后續研究提供了科學依據。