糖尿病腎病患者NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化水平與危險因素分析

劉愷遠 牟新

糖尿病腎病（diabetic kidney disease,DKD）作為糖尿病常見的微血管并發癥之一，以持續尿蛋白及腎功能下降為主要臨床表現，是導致終末期腎臟疾病（end stage renal disease,ESRD）的最主要病因之一[1]。DKD的病因及發病機制錯綜復雜，包括表觀遺傳（主要包括DNA甲基化）、終末糖基化產物形成、血流動力學異常、炎癥反應和細胞因子、氧化應激及腎小球足細胞損傷、腸道菌群改變等[2-5]。越來越多的證據提示表觀遺傳在DKD發病過程中起重要作用，內外環境因素改變引起表觀遺傳變化，例如長期高糖環境引起的DNA甲基化與DKD的發生密切相關[6]。本研究采用甲基化特異性PCR法（methylation-specific PCR,MS-PCR）及非甲基化特異性PCR法（non-methylation-specific PCR,UMS-PCR）檢測 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化水平，探討甲基化水平與危險因素的相關性，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016年10月至2017年10月杭州市紅十字會醫院收治的單純糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者（DM組）及DKD患者（DKD組）各20例。另擇同期體檢健康者20名作為對照組。DM組男10例，女 10例，年齡 38～83（62.6±11.15）歲；DKD 組男 14例，女 6例，年齡37～80（64.15±11.86）歲；對照組男10例，女10例，年齡47～69（60.40±5.64）歲。3組對象性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。納入標準：對照組既往身體健康，無糖尿病等慢性病；DM組符合1999年WHO糖尿病診斷及分型標準中糖尿病診斷且非DKD患者；DKD組有明確的糖尿病病史，尿白蛋白排出率在6個月內連續2次＞20 μg/min（或＞30 mg/24 h），或蛋白尿（＞0.5 g/24 h），或腎臟穿刺證實符合DKD診斷[7]。排除標準：原發性腎臟病及其他腎臟病，腎動脈狹窄性高血壓；半年內惡性高血壓、心腦血管意外、高血糖高滲性昏迷等急危重癥病史者；合并有心、肝、肺、腦和造血系統等嚴重原發性疾病，精神病者；癌癥、妊娠及哺乳期者。本研究經本院醫學倫理委員會審核通過[批準文號：（2020）快審第（198）號]，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集所有對象血壓、身高、體重等一般資料。采用自動血生化分析儀（寧波瑞源生物科技有限公司）檢測血肌酐、尿素氮、FPG等指標。采用全自動糖化血紅蛋白分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）、高壓液相色譜法檢測糖化血紅蛋白（hemoglobin A1C,HbA1C）。采用全自動尿生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）、免疫透射比濁法和苦味酸法檢測尿微量白蛋白與肌酐比值（urinary albumin creatinine ratio,UACR）。

1.2.2 全血DNA提取及亞硫酸氫鈉修飾 收集所有對象肘靜脈血2 ml，用DNA提取試劑盒提取靜脈血中的DNA，用微量紫外分光光度計測定260 nm和280 nm吸光值（A），計算DNA含量，-80℃冰箱保存備用。應用甲基化試劑盒按照說明書進行DNA亞硫酸氫鈉修飾處理。

1.2.3 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因 DNA甲基化水平檢測 采用MS-PCR和UMS-PCR法。將亞硫酸氫鈉處理過的DNA用甲基化引物及非甲基化引物分別進行擴增。引物由Methyl Primer Express v1.0設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應體系 為 50 μl，其 中 H2O 34.8 μl，5×buffer GC 10 μl，dNTP 1 μl；Primer 1 μl，Primer 1 μl，Template 2 μl，Taq 0.2 μl。PCR條件及設定反應程序：95℃預變性3 min，94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，運行40個循環，72℃修復延伸7 min結束反應。由于直接用甲基化引物擴增不理想，先用巢式引物擴增后，稀釋40倍作為模板擴增甲基化和非甲基化引物。使用180 V、50 min、1.2%的瓊脂糖電泳，置于凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）上拍照保存備檢。采用Image J軟件分析MS-PCR條帶灰度值（M）和UMS-PCR條帶灰度值（U），甲基化率=M/（M+U）。PCR引物序列、產物大小見表1。

1.3 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。血清AKR1B1基因DNA甲基化相關因素分析采用線性相關性檢驗和多元線性回歸法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組臨床指標比較 DM組、DKD組FPG、HbA1C均高于對照組（均P＜0.01）。DKD組BMI高于對照組（P＜0.05），血尿素氮水平高于對照組及DM組（均P＜0.05），UACR高于DM組（均P＜0.01）。見表2。

表2 各組臨床指標比較

2.2 各組 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化率比較 DKD組FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化率較DM組升高，DM組甲基化率均較對照組升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。3組NTN4、MTHFR甲基化率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表3。3組對象 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1 DNA基因的MS-PCR及UMS-PCR擴增電泳圖見圖1。

圖1 3組對象NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因的MS-PCR及UMS-PCR擴展產物電泳圖

表3 各組 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化率比較（%）

2.3 DKD患者AKR1B1甲基化率的危險因素分析對DKD患者的AKR1B1基因危險因素進行分析，包括年齡、BMI、血肌酐、LDL-C、糖尿病病程、HbA1C、UACR等指標，結果顯示，AKR1B1基因DNA甲基化率與HbA1C、UACR 均呈負相關（r=-0.593、-0.564，均 P＜0.05），見表4。將HbA1C、UACR納入多元回歸分析，結果顯示，HbA1C、UACR與AKR1B1基因DNA甲基化率相關（β=-0.517、-0.471，均P＜0.05），HbA1C、UACR越高，AKR1B1基因DNA甲基化率越低，見表5。

表4 DKD患者AKR1B1基因DNA甲基化率的危險因素分析

表5 DKD患者AKR1B1基因DNA甲基化率危險因素的多元回歸分析

3 討論

表觀遺傳學是不涉及DNA結構變化的可遺傳性改變，其中DNA甲基化是最主要表觀遺傳方式之一[8]。DNA甲基化的是在二核苷酸胞嘧啶上添加一個甲基的化學修飾過程。研究發現，高糖等異常環境因素影響下，DNA甲基化狀態發生改變，會使基因表達發生上調與下調，最終損傷腎臟，DNA甲基化參與了DKD的發病過程[9]。Sapienza等[10]通過西班牙和非洲裔美國ESRD及單純DM兩組患者的唾液樣本，比較了14 000個DNA甲基化的差異基因，得出 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1等 39個基因與DKD進展密切相關。本研究未采用上述研究的唾液樣本，采用外周血樣本為對象研究DNA甲基化情況，結果提示DKD患者血液中FZD2及AKR1B1基因DNA甲基化水平顯著高于DM組和對照組；在NTN4、MTHFR基因DNA甲基化中未觀察到差異。提示FZD2、AKR1B1基因血中的甲基化率升高可能參與了DKD的發病過程。

卷曲蛋白2（frizzled2,FZD2）屬于卷曲蛋白家族系統，是WNT信號通路的重要配體之一，對于FZD2目前研究集中在癌癥細胞生長與侵襲上，FZD2蛋白能通過肝細胞、乳腺上皮細胞上皮到間充質改變，使乳腺癌、肝癌等癌癥侵襲性增強[11-12]，但FZD2基因DNA甲基化對DKD影響是否同樣通過上皮細胞EMT改變達成尚不明確。

有研究證實，AKR1B1基因通過全基因組關聯，是目前已發現的幾個DKD的遺傳因子之一[13]，足以證明其在DKD發病中的重要作用，AKR1B1是編碼醛糖還原酶（aldose reductase,AR）的基因，AR參與了經典的多元醇通路，是該通路極為關鍵的限速酶，會導致山梨醇堆積，增加了氧化應激，使細胞內呈高滲狀態、細胞水腫、缺氧，從而導致腎臟、眼底及周圍神經的損傷[14-15]，在臨床上AR抑制劑如依帕司他治療DKD、糖尿病視網膜病變及周圍神經病變效果顯著[16]。本研究結果提示，在DKD組中AKR1B1基因DNA的低甲基化水平與HbA1C及UACR增高有關，提示在DKD患者中AKR1B1基因DNA的甲基化水平越低，血糖及尿蛋白水平越高，與Ademir等[17]的研究結果相似。由此推斷AKR1B1基因可能有潛力成為DKD的早期生物標志物，AKR1B1基因DNA甲基化可能通過多元醇途徑影響DKD的進展。

NTN4、MTHFR基因DNA甲基化率無明顯變化，可能此兩個基因發生的甲基化改變主要集中在唾液樣本中，而非血液中，也證實相同一個基因在人體不同組織中甲基化率也存在差異[9]。

綜上所述，FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化可能參與了DKD的發生、發展過程，AKR1B1基因DNA甲基化程度與HbA1C及UACR之間呈負相關。但本研究有一定局限性，未測定24 h尿蛋白量，在DKD早期，UACR準確性與24 h尿蛋白基本等同，但在大量蛋白尿期仍需測定24 h尿蛋白量，有待后續進一步研究證實。