基于生物信息學分析FOXO4在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

吳承帥 陳兵海

腎細胞癌是泌尿系統中次于膀胱癌的常見惡性腫瘤。腎細胞癌中以腎透明細胞癌最常見，故通常以腎癌簡稱。腎癌對傳統放化療的敏感性低，手術切除仍是局部腎癌的主要治療方法。然而，高達40%的局部腎癌在手術切除后最終仍可發展為轉移性腫瘤[1]。盡管多種靶向藥物已廣泛應用于腎癌患者的治療，但患者的中位生存時間依舊低于預期[2]。因此，迫切需要尋找腎癌早期診斷的標志物和治療的靶標。

叉頭框蛋白 O4（forkhead box protein O4,FOXO4）是FOXO家族的一員，可參與細胞能量代謝調節及細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程。在前列腺癌、胃癌、肺癌、結直腸癌、膀胱癌、膠質瘤等腫瘤組織中的表達明顯低于正常組織，且FOXO4表達水平與這些腫瘤的進展或預后密切相關[3-9]。Wang等[10]用腎癌組織與正常組織檢測FOXO4 mRNA和蛋白表達水平，結果顯示FOXO4 mRNA和蛋白表達水平均較正常組織明顯降低，并通過調節Bim而誘導腎癌細胞凋亡。然而，FOXO4在腎癌中的其他作用及預后價值尚不清楚。因此，本研究利用在線數據庫中更大樣本分析FOXO4表達水平，并探討FOXO4對腎癌細胞生存能力的影響，分析其表達與臨床預后的關系及表達調控機制，為進一步研究FOXO4在腎癌發生、發展中的作用和機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 Oncomine數據庫可視化分析腎癌中FOXO4的表達 Oncomine數據庫（https://www.oncomine.org/）是一個可用于檢索基因表達的公共數據資源庫[11]。首先，在搜索框中輸入FOXO4，對FOXO4基因在不同癌癥類型（cancer vs.normal）中的mRNA表達進行可視化分析。閾值條件設置如下：P值為0.05，fold change為all，gene rank為top 10%，date type為 all。隨后，對FOXO4在腎癌的4個芯片數據集（包括Gumz Renal Statistics、Lenburg Renal Statistic、Jones Renal Statistics、Beroukhim Renal Statistics）中的mRNA表達進行可視化分析。腎癌樣本和相應正常腎組織樣本的數量、差異倍數和P值都在可視化結果中顯示。

1.2 UALCAN數據庫分析腎癌中FOXO4 mRNA和蛋白表達水平 UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/）是一個用于分析腫瘤數據的交互式網絡資源庫[12]。基于腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和臨床蛋白質組學腫瘤分析聯盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium,CPTAC）數據庫的數據，運用UALCAN平臺對腎癌樣本和正常腎組織樣本中FOXO4 mRNA和蛋白表達進行分析和可視化。具體如下，選擇UALCAN中的“TCGA analysis”工具，在搜索框中輸入FOXO4，根據個體癌癥分期和腫瘤分級，評估FOXO4在所有腎癌樣本和不同亞組中腎癌樣本中的mRNA表達水平。類似地，使用UALCAN的“CPTAC analysis”工具，在搜索框中輸入FOXO4，根據樣本類型評估FOXO4在腎癌樣本中的蛋白表達水平。

1.3 細胞培養 769-P、786-O腎癌細胞系及HEK293T細胞均源自美國模式培養物集存庫。HK-2腎小管上皮細胞及其HK-2專用基礎培養基均購自上海中喬新舟生物科技有限公司。腎癌細胞系用1640完全培養基培養，而HEK293T細胞用DMEM完全培養基培養。完全培養基由10%FBS、1%青霉素-鏈霉素混合液及無血清培養基配制而成。FBS和無血清培養基均購自南京福麥斯生物科技有限公司，青霉素-鏈霉素混合液購自上海生工生物工程有限公司。所有細胞均培養于37℃，5%CO2的孵育箱中。

1.4 FOXO4 mRNA表達水平檢測 采用RT-qPCR法。根據組織/細胞RNA快速提取試劑盒（上海超研生物科技有限公司）說明書提取細胞總RNA，應用紫外分光光度儀檢測總RNA的濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）說明書進行逆轉錄和基因擴增。逆轉錄反應條件為：50℃ 15 min，85℃ 2 min；PCR反應條件為：95℃ 30 s，95℃10 s，60℃30 s，循環次數設為40。熔解曲線用于評估引物的特異性，其程序條件為：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceralde-3-phosphata dehydrogenase,GAPDH）為內參基因 。FOXO4引 物序 列 ：上 游 5'-CAGCCCTTCAGCCTATTCAG-3'， 下 游 5'-CTTGCCCAGCAAGAACTAGG-3'；GAPDH 引物序列：上游5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'， 下 游 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 計 算FOXO4相對表達水平。熒光定量PCR儀（型號：QuantStudio 5）購自美國Applied Biosystems公司。

1.5 FOXO4過表達 采用CRISPR/dCas9方法使FOXO4過表達[13]。具體如下，遵照SanPrep去除內毒素質粒提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）說明書提取MPH、dCas9、REV、GAG、VSVG和MS2-sgRNA-FOXO4質粒。REV、GAG和VSVG用于構建慢病毒載體，它們的質量比為：REV∶GAG∶VSVG=1 714 ng∶857 ng∶429 ng。隨后，應用轉染實驗分別在HEK293T細胞中構建Lenti-MPH、Lenti-dCas9和Lenti-FOXO4，且使它們相繼轉染到腎癌細胞系（769-P和786-O）。設置769-P和786-O細胞同時過表達MPH、dCas9后為對照組，再以對照組為基礎過表達FOXO4后為實驗組即FOXO4（+）。采用RT-qPCR法檢測轉染細胞中FOXO4 mRNA表達水平，選擇穩定過表達FOXO4的細胞作進一步研究。

1.6 細胞存活能力檢測 采用溴化噻唑藍四氮唑（MTT）法。收集實驗組FOXO4（+）和對照組對數生長期細胞并用細胞計數板進行計數。將5×103個細胞接種于96孔板中，放置在37℃培養箱中培養0、24、48、72 h。隨后，將20 μl MTT（上海生工生物工程有限公司）試劑加入板中，將細胞與MTT試劑溶液（5 mg/ml）共同孵育4 h。接著將細胞與200 μl二甲基亞砜一起孵育10 min后，在酶標儀上測量每個孔在570 nm處的吸光度值。酶標儀（型號：MULTISKAN GO）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.7 FOXO4表達與腎癌預后的關系 Kaplan-Meier plotter在線數據庫（http://kmplot.com/）用于評估大量基因表達對21種腫瘤預后的影響，包含530個腎透明細胞癌樣本[14]。本研究利用該數據庫來評估FOXO4表達在腎癌中的預后價值。根據FOXO4 mRNA表達的中位值和自動選擇最佳截斷值將腎癌樣本分為高表達組（227個樣本）和低表達組（303個樣本），通過Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗分析FOXO4表達與總生存期（overall survival,OS）之間的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

1.8 預測和分析調節FOXO4在腎癌中表達的miRNA研究表明FOXO4在許多腫瘤類型中的表達受miRNA調控[15]。因此，本研究探討FOXO4在腎癌中的表達是否也受miRNA調節。為此，本研究使用StarBase、miRDB、TargetScan和miRcode數據庫預測FOXO4的潛在調控miRNA。這4個數據庫預測的共同miRNA被認為是FOXO4表達調控的潛在miRNA。此外，StarBase數據庫中的517個腎癌樣本和71個正常對照樣本也用于分析潛在miRNA的表達，以及使用517個腎癌樣本分析FOXO4與其miRNA調節因子在腎癌中的表達相關性，根據miRNA表達的中位值將517個腎癌樣本分為高表達組（258個樣本）和低表達組（259個樣本），分析預后關系。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗 1.8結果顯示hsamiR-142-3p是調控FOXO4表達的miRNA。本研究進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證FOXO4與hsa-miR-142-3p的靶向調節作用關系。首先，應用StarBase數據庫獲得FOXO4與miR-142-3p的結合序列，在此基礎上設計并合成野生型FOXO4-3'UTR和突變型FOXO4-3'UTR序列，將這兩個片段克隆到pmir-GLO熒光素酶報告基因載體上，分別構建FOXO4野生型載體（FOXO4-WT）和FOXO4突變型載體（FOXO4-MUT）。接著，擴增重組載體，并用SanPrep去除內毒素質粒提取試劑盒提取重組質粒。隨后，將HEK293T細胞接種于24孔板中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。將FOXO4-WT和FOXO4-MUT質粒和miR-142-3p模擬物或miR-142-3p陰性對照通過Lipofectamine 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司）分別共轉染到293T細胞中。48 h后，通過雙熒光素酶報告基因試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）檢測熒光素酶的活性。

1.10 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0統計軟件。計量資料兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。在Kaplan-Meier plotter數據庫中使用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗進行預后分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎癌中FOXO4 mRNA和蛋白表達 通過Oncomine數據庫發現，大多數腫瘤，包括腎癌中FOXO4 mRNA表達下調（圖1a，見插頁）。進一步分析FOXO4在不同腎癌數據集中的mRNA表達發現，與正常腎組織樣本相比，腎癌樣本中FOXO4 mRNA表達水平明顯降低（均P＜0.01）（圖1b，見插頁）。隨后，利用UALCAN平臺中來自TCGA數據庫的更多腎癌樣本分析了FOXO4 mRNA表達水平，與上述結果一致，腎癌樣本中FOXO4 mRNA表達水平亦明顯低于正常腎組織樣本（P＜0.01）（圖2a）。此外，與正常腎組織樣本相比，不同癌癥分期和腫瘤分級亞組中FOXO4 mRNA表達水平均降低（均P＜0.01）；與Ⅰ期亞組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期亞組中FOXO4 mRNA表達水平均降低，而其表達在任何兩個腫瘤分級亞組中差異均有統計學意義（均P＜0.01）（圖2b和c）。利用UALCAN平臺比較了CPTAC數據庫的腎癌樣本與正常腎組織樣本中FOXO4蛋白表達，結果顯示，與正常腎組織樣本相比，腎癌樣本中FOXO4蛋白表達水平下降（P＜0.01）（圖2d）。

圖2 UALCAN數據庫FOXO4在腎癌中的表達（a：腎癌樣本與正常腎組織樣本中FOXO4 mRNA表達箱線圖；b：基于腫瘤分期的腎癌亞組中FOXO4 mRNA表達箱線圖；c：基于腫瘤分級的腎癌亞組中FOXO4 mRNA表達箱線圖；d：腎癌樣本與正常腎組織樣本中FOXO4蛋白表達箱線圖）

2.2 FOXO4表達對腎癌細胞生存的影響 為研究FOXO4對腎癌細胞存活能力的影響，首先檢測了FOXO4在兩個腎癌細胞系中的表達。與腎癌組織結果一致，FOXO4在769-P和786-O細胞中的表達水平均低于人正常腎小管上皮細胞HK-2（圖3a）。通過CRISPR/dCas9將FOXO4表達水平上調后（圖3b），769-P和786-O細胞存活水平明顯降低（圖3c和d），表明FOXO4對腎癌細胞的生長起到抑制作用。

圖3 FOXO4表達對腎癌細胞生存的影響（a：FOXO4在腎癌細胞中的表達情況；b：通過CRISPR/dCas9方法在腎癌細胞中成功過表達FOXO4；c：FOXO4過表達的769-P細胞存活明顯降低；d：FOXO4過表達的786-O細胞存活明顯降低）

2.3 FOXO4表達與腎癌不良預后的關系 Kaplan-Meier plotter在線數據庫用于分析FOXO4表達與腎癌預后的關系，結果顯示，FOXO4低表達組總生存率低于高表達組（P＜0.05）（圖4），表明FOXO4在腎癌中具有預后預測價值，可以作為一個新的預后生物標志物。

圖4 FOXO4在腎癌中的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 FOXO4在腎癌中表達的miRNA調控因子的分析 通過整合4個在線數據庫來預測FOXO4表達的miRNA調控因子，共獲得715個miRNA。其中，hsamiR-142-3p是這4個數據庫的共同miRNA（圖5a）。分析StarBase數據庫的腎癌樣本及正常對照樣本數據發現，與正常對照樣本相比，腎癌樣本中hsa-miR-142-3p表達明顯上調（圖 5b），hsa-miR-142-3p與FOXO4表達呈明顯負相關（圖5c），表明它們之間可能存在靶向調控關系。此外，本研究發現hsa-miR-142-3p高表達不利于腎癌的預后（圖5d），這與FOXO4低表達的預后意義一致。

圖5 腎癌中調節FOXO4表達的miRNA基因的預測和分析（a：FOXO4表達的預測miRNA調節因子的韋恩圖；b：腎癌中hsamiR-142-3p表達的箱線圖，**P＜0.01；c：腎癌中hsa-miR-142-3p與FOXO4的共表達分析；d：腎癌中hsa-miR-142-3p的Kaplan-Meier生存曲線）

2.5 Has-miR-142-3p與FOXO4在腎癌中具有靶向調控關系 基于目標基因序列，本研究構建了兩種不同的FOXO4-3'UTR突變體（圖6a）。雙熒光素酶報告基因結果顯示，在野生型FOXO4-3'UTR細胞中，熒光素酶活性相對降低，而FOXO4-3'UTR的兩個突變型都抑制了熒光素酶活性的降低（圖6b），表明FOXO4是hasmiR-142-3p在腎癌中調控的靶基因。

圖6 FOXO4受has-miR-142-3p靶向調節（a：構建FOXO4-3'UTR突變型序列；b：FOXO4-3'UTR的兩種突變體都阻滯了熒光素酶活性的降低，*P＜0.05，nsP＞0.05）

3 討論

FOXO家族是FOX蛋白家族的一個亞家族，由FOXO1、FOXO3A、FOXO4和FOXO6 4個成員組成，這些成員參與著多種生理、病理過程，如細胞分化、存活和細胞代謝等[16-18]。在人類腫瘤發生、發展中，它們可以抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，因而被認為是腫瘤抑制因子[19]。以往研究表明，FOXO4表達在多種人類腫瘤類型中明顯下調，與腫瘤的發生、侵襲、轉移及患者預后密切相關[20]。本研究結果表明FOXO4表達亦在腎癌中顯著降低，mRNA轉錄水平和蛋白水平，這與已報道的的研究結果一致[10]。在體外實驗中，本研究發現腎癌細胞中FOXO4也低表達，而FOXO4高表達可降低腎癌細胞的存活能力，表明FOXO4在腎癌中發揮抑癌作用。此外，本研究發現FOXO4低表達與腫瘤分級和分期有關，FOXO4低表達與腎癌患者的不良預后有關，表明FOXO4在腎癌進展中發揮重要作用，也有望成為腎癌新的預后生物標志物。

機制上，先前的研究已表明FOXO4是miRNA促進腫瘤發生、發展的重要靶標[15，19]。例如，Wang等[21]揭示了miR-1274a可通過靶向FOXO4并抑制其表達而促進胃癌細胞的生長和遷移。Liu等[22]研究結果顯示miR-499-5p可通過調節FOXO4表達而加速直腸癌細胞的侵襲和遠處轉移。相似的研究結果也在宮頸癌、肺癌、鼻咽癌、骨肉瘤、結腸癌等腫瘤中有報道[23-27]。然而，在各種腫瘤類型中調節FOXO4表達的miRNA是不同的，這表明FOXO4表達的miRNA調節因子具有腫瘤類型依賴性。值得注意的是，FOXO4在腎癌中表達的miRNA調節因子尚未有研究報道。因此，本研究試圖探尋FOXO4在腎癌中表達的miRNA調節因子。結果顯示，hsa-miR-142-3p是不同預測數據庫中FOXO4的共同miRNA。腎癌中hsa-miR-42-3p表達水平上調并與FOXO4表達呈負相關，表明hsa-miR-142-3p與FOXO4具有靶向調節關系。隨后，本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了它們的靶向關系。

Hsa-miR-142-3p是一個重要的調節因子，在包括癌癥在內的多種疾病中發揮重要作用[28]。先前的研究已表明hsa-miR-142-3p在腎癌組織中顯著上調并作為致癌基因發揮作用，下調hsa-miR-142-3表達可抑制腎癌細胞的生存、侵襲能力，以及誘導細胞凋亡[29]。然而，hsa-miR-142-3p在腎癌中的分子機制尚未被揭示。因此，本研究結果或可為hsa-miR-142-3p參與腎癌發生、發展的機制提供一定的證據和補充。

綜上所述，FOXO4參與了腎癌的發生、發展，有望作為腎癌的潛在分子標志物和治療靶點。此外，本研究結果也可能為探尋hsa-miR-142-3p在腎癌中發揮作用的機制提供重要線索。