新型鎂合金生物材料的體內外相容性研究

高質涵，高銘澤，孫 藝，劉海峰，付高潔，肖 陽

(1. 牡丹江醫學院醫藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011) (2. 牡丹江醫學院醫學影像學院，黑龍江 牡丹江 157011) (3. 東北財經大學工商管理學院，遼寧 大連 116000) (4. 牡丹江醫學院附屬第二醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

1 前 言

可生物降解金屬在醫學領域引起了越來越多的關注，因為它們在達到所需功能后可以自行降解，減少帶給患者的經濟和身體負擔，適合作為臨時固定的骨科植入物使用。鎂材料被視為最適合用作新一代人體植入材料的可生物降解金屬[1]。近年來，眾多研究表明，鎂合金具有優異的生物相容性和物理特性，可用于醫療應用，尤其是作為骨科和頜面植入物[2]。目前應用于臨床的植入物材料包括不可降解金屬(例如鈦合金)和可生物吸收的聚合物[3]。盡管鈦合金材料目前已被廣泛使用，但這種材料具有一定的局限性，主要包括對周圍骨骼的應力屏蔽，必要時需要做去除植入物的翻修手術以及在術后一段時間可能發生變形。此外，近年來研究發現，這些不可降解金屬會產生有害的磨損顆粒，從而導致植入物松動和故障，甚至發生骨溶解[1-3]。可降解的可生物吸收聚合物往往缺乏承載植入物[4]所需的機械強度。聚合物植入物在手術期間和術后發生斷裂的情況已被報道，這種情況下患者的恢復更加復雜，引起了人們對植入材料安全性的擔憂[5-9]。此外，可生物吸收的聚合物材料還會產生酸性降解產物，從而進一步導致植入失敗和組織炎癥。

鎂基植入物的主要優點在于鎂的生物可降解和可吸收特性，其中鎂的降解產物可被排泄或用于代謝過程，并且其機械性能與皮質骨相當。鎂是人體細胞內和細胞外液中最豐富的陽離子之一，對骨骼和牙齒的形成至關重要。人體中50%～60%的鎂存在于骨骼中，其中細胞外液的鎂離子濃度在0.70～1.05 mmol/L之間，人體通過腎臟和腸道來維持體內鎂離子的穩態。盡管鎂是一種有前途的適用于承重醫療植入物的材料，但它由于在生理條件下降解得太快而無法滿足臨床要求[10-13]。鎂合金的降解速率應足夠慢，以便在組織再生前保持植入物的承載性能?？焖俳到鈺е逻^早的機械故障或植入物脫落，并增加局部pH值。與純鎂材料相比，合金化可以不同程度地降低鎂合金材料的降解速率，提高其機械性能，同時促進骨骼的形成等[14-16]。因此，應進一步研究并優化鎂合金成分，以改善應用于骨科和頜面修復領域中的鎂合金植入物的生物降解性、生物活性、生物相容性和機械性能等。

與純鎂相比，改善鎂合金材料的降解性能及與細胞相互作用的研究可以潛在地控制其晶粒尺寸、表面微觀結構、降解及機械性能[16-20]。鎵(Ga)和鍶(Sr)作為合金元素除了可以提高鎂合金的物理和機械性能外，Ga還具有一定的抗菌能力，研究發現Ga在骨代謝中也發揮著一定的作用；Sr具有與鈣(Ca)類似的化學特性，主要集中在骨骼中的骨小梁處[21, 22]。另外，研究發現，Sr可以改善骨質疏松癥患者的骨質量和結構完整性[23-26]，且可以改善羥基磷灰石水泥的降解和生物相容性[27, 28]。本研究在純鎂中加入不同質量分數的Ga和Sr元素制備了鎂合金材料，探索了這些鎂合金材料在體內外的相容性及是否有促進骨愈合的能力。此外，還選用人脊髓間充質干細胞(human marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)培育法對鎂合金體外生物相容性效果進行評價，并將材料植入到SD大鼠股骨內以此來評價材料在體內的相容性和對骨愈合的促進作用。

2 實 驗

2.1 樣品制備

實驗材料用高純度金屬Mg(99.95%，雜質含量≤0.05%)和商業級純度金屬Ti由澳大利亞奧古斯特金屬合金公司提供。Mg-0.1Ga，Mg-0.1Sr和Mg-0.1Ga-0.1Sr(質量分數)鑄錠是通過真空感應熔煉法融化純Ga(99.9%)、Sr(99.9%)(Alfa Aesar，美國)和高純Mg共同制備的。將原材料Mg，Ga和Sr儲存在陰涼、干燥和密封的環境中，將制備的鎂合金樣品放置在真空干燥設備中，以避免在露天環境中的污染和氧化(腐蝕)。為了最大程度地減少熔融Mg的氧化和燃燒，將爐膛抽真空至0.2～1 MPa、加溫至約50 ℃，并用保護性氬氣吹掃。將與熔融鎂接觸的設備(包括攪拌器、熱電偶保護器和模具)均預先噴灑涂覆石墨，以減少鐵的污染。將金屬混合物以3～5 ℃/s的升溫速率加熱到760 ℃，并保持25～30 min，每5 min劇烈攪拌一次；然后將熔體轉移到預熱至250 ℃(以減少收縮)的矩形模具中，并自然冷卻至室溫；將純鎂、鎂合金和純鈦分別加工成直徑為15 mm、厚度為3 mm的圓片狀和直徑為1 mm、長為10 mm的棒狀試樣，以進行體外相容性實驗以及動物實驗。在實驗之前，使用蒸餾水作為潤滑劑，用砂紙對加工后的樣品進行機械打磨直到2000粒度，然后分別在丙酮、乙醇(96%)和去離子水中超聲清洗5 min，后在通風櫥內風干備用。

2.2 體外實驗

采用hMSCs進行體外細胞毒性評價(hMSCs細胞購買于上海澤葉生物科技有限公司)。將含有16% 胎牛血清(Gibco，美國)和1%雙抗的杜氏改良Eagle培養基(DMEM，Gibco，美國)與hMSCs細胞共同培養24 h后，用胰酶將貼壁的hMSCs從培養液中分離出來，用計數板計數。將hMSCs細胞以1×104/孔的密度接種于24孔板的培養基中(每組3孔)，培養24 h使細胞獲得最佳粘附后，再與制備的鎂合金樣品在DMEM培養基中浸泡72 h。后用溴化乙錠(EB)和吖啶橙(AO)染色15 min，用磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline，PBS)溶液沖洗3次，然后采用激光共聚焦顯微鏡(CLSM，奧林巴斯，FV1000)進行觀察，以此來評價各組培養基中細胞的增殖情況。

2.3 體內實驗

體內實驗采用牡丹江醫學院動物實驗中心提供的3個月的無特定病原體(SPF)級 SD大鼠36只，其平均體重為215 g(140～228 g)。將大鼠隨機分成6組，每組6只。用聚維酮碘消毒后，在大鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.9 mL/100 g)對大鼠實施麻醉，確定穿刺點，并在股骨內上髁最高點位置使用克氏針定位鉆孔，沿通踝線方向鉆開直徑2 mm小孔，鉆透雙層皮質，并將準備好的材料插入鉆開的骨髓腔中，如表1和圖1所示。用骨蠟封閉，然后用無菌生理鹽水沖洗，逐層縫合(未給予抗生素)，手術后的大鼠被安置在無菌、通風的房間飼養。

表1 動物實驗設計分組

圖1 植入材料與大鼠股骨冠狀位(a)和矢狀位(b)示意圖Fig.1 Schematic diagrams of coronal view (a) and sagittal view (b) of planted material and femur of rats

2.3.1 X射線透視觀察

植入術后第3 d和第5 d，取出實驗大鼠進行呼吸麻醉，后進行X射線透視觀察。

2.3.2 Micro-CT掃描

植入術后7 d，將大鼠處以安樂死，后取出股骨標本固定，并進行Mirco-CT掃描(哈爾濱醫科大學分子影像研究中心，SuperArgus 小動物PET/CT)。

2.3.3 掃描電鏡觀察

將20 g重鉻酸鉀溶于40 mL蒸餾水中，邊攪拌溶解邊加入400 mL濃硫酸配置得到鉻酸溶液，將Mirco-CT掃描后的股骨標本材料用鉻酸洗液清洗表面化合物沉積，然后使用掃描電鏡(德國蔡司，SIGMA500)觀察植入材料的表面形貌。

2.4 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對細胞計數數據進行統計分析，3組間比較采用方差分析。數據資料比較采用卡方檢驗。

3 結果與討論

3.1 體外相容性

純鎂、各組鎂合金材料和純鈦對hMSCs的細胞毒性結果如圖2所示。其中具有完整細胞膜的活細胞被染色成熒光綠色，而具有受損細胞膜的死細胞被染色成熒光紅色。由圖2a～2f可以明顯看出，空白組細胞(圖2f)顯示出良好的細胞擴散能力且幾乎沒有死亡細胞；純鈦組細胞仍能很好地分布(圖2e)，同空白對照組結果相似；純鎂組及鎂合金材料組中，可以在培養基中觀察到一定比例的死細胞(圖2a～2d)，進一步觀察發現，鎂合金材料Mg-Ga-Sr的培養基中死亡細胞比例低于Mg、Mg-Sr和Mg-Ga的，這表明Mg-Ga-Sr鎂合金材料對細胞的毒性較小。通過Image J軟件對細胞熒光染色圖進行細胞計數，死亡細胞占比數據結果如圖2g所示。相較于純鈦，純鎂和鎂合金材料都顯示出一定的細胞生長抑制性；相比鎂合金材料，純鈦與細胞展現出更加兼容的狀態，這表明在體外環境鎂合金材料的降解過程尤其是在早期階段會對細胞增殖產生一定的抑制作用，這可能是鎂合金材料在培養基中降解釋放的OH離子、過量的Mg離子以及Ga離子和Sr離子所致。

圖2 各實驗組細胞熒光染色照片，綠色為活細胞，紅色為死亡細胞(a～f)；用Image J軟件分析得到的死亡細胞占比數據(g)Fig.2 Fluorescent staining pictures of cells in each experimental group, green is the living cells and red is the dead cells (a～f); the proportion of dead cells analyzed by Image J software (*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001) (g)

3.2 體內相容性

3.2.1 X射線透視結果

大鼠術后第3 d和第5 d兩個時間點麻醉拍攝的X射線透視照片如圖3所示。其中黑色箭頭指示材料所在部位，白色箭頭指示氣腔。由圖3可以看出，隨著時間的延長，純鎂和鎂合金材料體積逐漸縮小，對比純鈦和空白組(圖3e和3f)，植入初期鎂合金材料周圍形成了一些氣腔(圖3a～3d)，這些氣腔是鎂合金材料降解產生；隨著時間的推移，氣腔逐漸縮小(圖3g～3j)，一是因為被機體自行吸收，二是純鎂和鎂合金表面形成的氧化層減緩了降解速率。由圖3g～3j可以看到，Mg-Ga-Sr合金組氣腔小于其他組，表明加入Ga和Sr元素可以延緩鎂合金材料的降解速率，從而使反應產生的氣體減少。

圖3 各實驗組術后第3 d(a～f)和第5 d(g～l)大鼠X射線透視照片Fig.3 X-ray fluoroscopy images of rats in each experimental group at 3rd (a～f) and 5th (g～l) after surgery

3.2.2 Micro-CT結果

大鼠術后7 d安樂死后的股骨Micro-CT掃描照片如圖4所示。對比鎂材料組(圖4a～4d)，純鈦組與空白對照組(圖4e和4f)周圍無任何白色信號。此外，可以看到加入Sr元素的鎂合金周圍有不同程度的線性不規則白色信號影(鈣鹽沉積)，Micro-CT顯影程度表明，Mg-Sr及Mg-Ga-Sr材料周圍的沉積顯影比其他材料組更為明顯。這表明加入Sr元素可以提高鎂合金材料促進骨愈合的能力。

圖4 各實驗組術后7 d股骨樣本的Micro-CT掃描照片Fig.4 Micro-CT scan images of the samples at 7 d after surgery in each experimental group

3.2.3 掃描電鏡結果

大鼠術后7 d后取骨組織中植入材料清洗，后拍攝的掃描電鏡照片如圖5所示，可以看出純鈦表面幾乎無任何改變，純鎂和鎂合金材料表面有不同程度的腐蝕痕跡，且鎂合金材料表面腐蝕痕跡更小，也進一步證明合金化可以減緩鎂材料的降解。

圖5 術后7 d植入材料清洗后的掃描電鏡照片Fig.5 SEM images of the planted material surface after material removal and clean at 7 d after operation

從臨床角度來看，理想的鎂材料植入物應在一定時間段內具有良好的支持作用，以適應骨折的愈合過程，并向周圍組織釋放無毒無害物質。鎂合金材料具有較高的化學和電化學活性，在與生理環境接觸后容易發生降解(或腐蝕)。目前的研究工作主要集中于探索抑制鎂合金降解動力學的方法，以滿足臨床要求，即植入物在12～18周內仍可保持較好的機械強度[27-29]。Wang等[17]首次提出通過將原始Mg基質與Sr合金化來控制Mg合金生物學性能的概念性工作，通過延緩Mg-Sr合金降解的方式，將Sr元素緩慢地釋放到生物系統中，使Sr元素發揮促進骨細胞生長的作用。本文在制備鎂合金材料時使用添加0.1%的Ga和0.1%的Sr元素的微合金化方案，是因為從電化學的角度來看，0.1%的Ga和0.1%的Sr含量遠低于兩種元素在鎂中的固溶度，因此不會產生微電偶而影響材料的降解速率。因此，在鎂材料中通過合金化方法加入具備其它作用的元素，不僅可以實現鎂材料功能化，還可以延緩鎂材料降解過快的問題。結合圖3中植入材料釋放的氣體量和圖5中植入材料表面形貌，可以看出Ga和Sr微合金化可以進一步減緩鎂材料的降解。

前期研究發現，鎂材料的過快降解會導致緩沖的生理介質的pH值急劇上升(高達10.0)，并釋放出過量Mg離子[3]，這些離子對包括成骨細胞在內的活生物體的大多數代謝功能均具有一定的毒性作用[30-33]。鎂材料在體外實驗中會對細胞增殖產生不同程度的抑制(圖2)，這主要是因為鎂材料降解導致培養基中Mg2+濃度高和pH迅速改變使得細胞生長環境發生轉變[34-36]。根據報道，當用含Mg離子的MEM培養基培養hMSCs時，100倍的稀釋提取物比10倍稀釋的培養基具有更低的抑制作用[25-30]，因此找到合適的鎂合金成分配比，使材料具備理想的降解率，可以使鎂合金材料具有良好的生物相容性。研究表明，DMEM中Sr離子的存在促進了hMSCs和成骨細胞的生長[7]。盡管目前尚未有研究明確定義Ga離子的體外生物相容性，但一些研究表明Ga離子的存在可能會促進破骨細胞的生長[3]，而相關機制還不明確。

體內模型是一種成本高昂但直接有效的實驗方法，可用于評估生物系統與植入材料之間的相互作用并為后續的臨床試驗提供參考。本研究采用基于SD大鼠的動物模型來對鎂合金材料進行體內評價，揭示了Ga離子和Sr離子在短時間內的釋放有助于骨組織恢復。圖4中的Micro-CT照片顯示，與純鈦相比，純鎂和鎂合金材料植入物周圍均有不同程度的鈣鹽沉積，加入Sr元素的鎂合金材料鈣鹽沉積的顯影較其他鎂材料更為明顯，而鈣鹽沉積是骨修復的前提條件，這一結果與文獻報道一致[35, 36]。體內動物實驗結果表明，實驗動物在鎂合金材料植入后骨損傷在一定程度上得到了修復，與體外實驗結果不同(表現出對細胞的抑制作用)，分析認為鎂材料體外生物相容性實驗表現出對細胞的抑制作用和培養基的固定性相關，培養基內環境組成固定，鎂材料降解釋放的離子濃度只會越來越高，而機體是一個時刻都在進行物質交換的大環境，材料降解產生的離子很少會在一處大量聚集，離子會通過體液交換代謝掉，因此鎂合金材料相容性在體內的實驗結果比體外實驗更具代表性。

4 結 論

本實驗研究發現通過向鎂材料中微量添加Ga和Sr元素的合金化手段可以減緩鎂合金的降解速率，同時Ga和Sr元素的加入可以促進骨組織恢復。鎂基合金材料作為新型臨床醫用材料具有廣闊的前景，而Ga，Sr元素以及Mg元素在機體中對骨愈合的促進作用的具體機制仍需更加深入的研究。