泥鰍表皮中活性成分提取工藝初步研究

肖 瑞，翁子依，段義君，糜志遠，張 佳

(湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068)

泥鰍是一種傳統的中藥材，享有“水中人參”的美名[1]，具有非常高的藥用以及食用價值[2]。《中華大詞典》記述其分泌的黏液可以入藥，具有味甘性平等特點[3-5]。現有研究顯示，泥鰍中含有多糖[6]、凝集素[7-8]、超氧化物歧化酶[9-10]、抗菌肽[11-13]以及透明質酸[14]等多種藥理活性成分。從泥鰍中分離出的多糖對人癌細胞系具有抗增殖以及凋亡等作用[15]，具有抗氧化增強免疫力等生理功能[16-18]。還有研究指出，泥鰍多糖對小鼠的免疫性肝損傷具有保護作用[19]。鑒于目前泥鰍活性物質的研究系統性、完整性不強，且尚不深入，本研究旨在從泥鰍表皮中活性物質的提取方法入手為泥鰍中活性物質的研究打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活泥鰍(購自武漢南湖綜合生鮮市場)。

95%乙醇，無水乙醇，葡萄糖，考馬斯亮藍G-250，硫酸，苯酚，牛血清白蛋白。以上試劑均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.2 儀器與工具

TGL-16C型離心機(上海安亭科學儀器廠制造)；UV-2550型紫外分光光度計(日本島津公司)；UPT-I-10T型超純水儀(四川優普超純科技有限公司)；BCD-232EJL/R小天鵝冰箱(江蘇小天鵝營銷有限責任公司)；BP121S 電子天平(德國賽多利斯集團公司)；0.1～5000μL移液槍(德國Eppendorf公司)；YB-2000A型粉碎機(永康市速鋒工貿有限公司)；s6恒溫水浴鍋(常州市華怡儀器制造有限公司)；LGJ-50F真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環水真空泵(鄭州予華儀器制造有限公司)；PNG-9096A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；IG-50紅外光譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.3 泥鰍表皮活性物質的制備

1.3.1泥鰍表皮的制備將市售活泥鰍置清水中靜養3～4 d，取出瀝干，置-20℃冷柜中冷凍24 h后取出，切成3～4 cm長段，置真空冷凍干燥機中，-50℃下預凍20 h，-45℃～-5℃升華除水40 h，-5℃～20℃二次干燥10 h，取出粉碎，過20目篩，取泥鰍皮裝袋備用。工藝流程見圖1。

圖1 泥鰍表皮的制備流程

1.3.2泥鰍表皮中活性物質的制備稱取泥鰍皮適量，按料液比1∶20加入超純水中，65℃提取2 h，冷卻至室溫，6000 r/min離心10 min，棄去沉淀，上清液加入10倍體積的95%乙醇，置冰箱中冷藏過夜，減壓過濾，棄去濾液，所得固體用無水乙醇洗3次，30℃干燥，即得泥鰍表皮活性物質(類白色至淡黃色粉末，以下簡稱活性物質)。

2 單因素試驗及結果

按上述制備方法，分別考察提取次數、提取溫度、提取時間以及料液比等因素對活性物質提取率的影響。

2.1 單因素試驗結果

2.1.1提取次數對活性物質得率的影響設定提取溫度為65℃、提取時間2 h、料液比1∶20等條件不變，觀察提取次數分別是1、2、3和4次時活性物質的得率(圖2)。從圖2可知，隨著提取次數的增加，活性物質得率呈現先增加后降低的趨勢，在提取次數為3次時最大，因此提取次數初步確定為3次。

圖2 提取次數對活性物質得率的影響

2.1.2提取溫度對活性物質得率的影響設定提取次數為3次、提取時間2 h、料液比1∶20等條件不變，觀察提取溫度分別是45℃、55℃、65℃和75℃時活性物質的得率(圖3)。從圖3可知，隨著提取溫度的增加，活性物質的得率呈現先增加后降低的趨勢，在提取溫度為65℃時有最大得率，因此提取溫度初步確定為65℃。

圖3 提取溫度對活性物質得率的影響

2.1.3提取時間對活性物質得率的影響設定提取次數為3次、提取溫度65℃、料液比1∶20等條件不變，觀察提取時間分別是1、2、3和4 h時活性物質的得率(圖4)。從圖4可知，隨著提取時間增加，活性物質得率呈現先增加后降低的趨勢，在提取時間為2 h時最大，因此提取時間初步確定為2 h。

圖4 提取時間對活性物質得率的影響

2.1.4料液比對活性物質得率的影響設定提取次數為3次、提取溫度65℃、提取時間2 h等條件不變，觀察料液比分別是1∶10、1∶20、1∶30和1∶40時活性物質的得率，結果見圖5。從圖5可知，隨著料液比的增加，活性物質的得率呈現先增加后降低的趨勢，在料液比為1∶20時有最大得率，因此料液比初步確定為1∶20。

圖5 料液比對活性物質得率的影響

3 正交試驗及結果

3.1 正交試驗優化設計

在單因素試驗的基礎上，選擇提取次數、提取溫度、提取時間以及料液比等因素，以活性物質得率為指標進行五因素四水平正交試驗(表1)。

表1 正交試驗因素水平設計

3.2 正交試驗結果

分別從浸提次數、提取溫度、提取時間以及料液比等方面對泥鰍活性粗提物得率進行正交試驗優化設計。正交試驗結果如表2所示。

表2 正交試驗結果

由表2可見泥鰍活性粗提物得率受影響的4個因素中，浸提次數最為顯著，其他三個因素依次為提取溫度、提取時間和料液比。最終試驗結果表明：泥鰍活性物質粗提最優方法是A3B3C2D2，即浸提次數3次、提取溫度65℃、提取時間2 h、料液比為1∶20，這個結果與單因素試驗結果基本一致。

4 泥鰍表皮活性物質中蛋白質和多糖的含量測定

4.1 多糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法測定泥鰍表皮活性物質中多糖的含量。

4.1.1線性范圍精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，置100 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶，定容，分別取上述溶液各1.0 mL置刻度試管中，各加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，混勻放置，待其冷卻至室溫，在波長490 nm處，測其吸光度，繪制A-C曲線。

4.1.2樣品測定精密稱取泥鰍活性物質10 mg置100 mL容量瓶中，加超純水溶解過濾，取濾液1.0 mL至刻度試管中，加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，混勻放置，冷卻至室溫，在波長490 nm處，重復測定三次該樣品溶液的吸光度，取平均值代入上述標準曲線中，計算多糖含量。

4.2 多糖含量的測定結果

按上述方法得到葡萄糖線性范圍(圖6)。在濃度0.01～0.05 mg/mL范圍內，葡萄糖濃度和吸光度呈良好線性，線性方程為y=12.52x+0.0682，R2=0.9994。樣品在490 nm處的吸光度測定結果見表3，吸光度測定的平均值為0.383，代入葡萄糖標準曲線得泥鰍活性物質中多糖含量為0.025 mg/mL，即25%。

圖6 葡萄糖標準曲線

表3 樣品的紫外吸收測定結果(490nm)

4.3 泥鰍表皮活性物質中蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法測定泥鰍表皮中活性物質中蛋白質的含量。

4.3.1線性范圍精密稱取牛血清白蛋白25 mg，置25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，精密吸取1、2.5、3.5、4.5和5.5 mL，分別置于10 mL容量瓶，定容，分別取上述溶液各0.1 mL置刻度試管中，各加入0.9 mL超純水、考馬斯亮藍G-250試劑5 mL，混勻放置，在波長595 nm處，測其吸光度，繪制A-C曲線。

4.3.2樣品測定精密稱取泥鰍活性物質100 mg置10 mL容量瓶中，加超純水溶解過濾，取濾液0.1 mL至刻度試管中，加入超純水 0.9 mL、考馬斯亮藍G-250試劑5 mL，混勻放置，在波長595 nm處，重復測定3次該樣品溶液的吸光度，取平均值代入上述標準曲線中，計算蛋白質含量。

4.4 蛋白質含量的測定結果

對泥鰍活性物質中蛋白質含量進行測定，蛋白質標準曲線見圖7。在濃度0.15～0.55 mg/mL范圍內，蛋白質濃度和吸光度呈良好線性，標準曲線方程為y=2.613x-0.2446，R2=0.9996。樣品在595 nm下吸光度測定結果見表4，吸光度平均值為0.149，代入蛋白質標準曲線，得泥鰍活性物質中蛋白質含量為0.15 mg/mL，即15%。

圖7 蛋白質標準曲線

表4 樣品的紫外吸收測定結果(595nm)

5 泥鰍活性物質的紅外圖譜

取適量泥鰍活性物質，測定其紅外光譜(KBr壓片法)，結果見圖8。由譜圖可知，3699 cm-1處應為N-H伸縮振動吸收峰(υN-H), 3304 cm-1為O-H伸縮振動吸收峰(υO-H), 2925 cm-1處中等強度的峰應為飽和碳氫的伸縮振動吸收(υC-H), 2854 cm-1處為氨基酸分子中NH3+(偶極離子)的特征吸收，羰基伸縮振動吸收(υC=O)則出現在1746 cm-1處，1659 cm-1應為羧酸根負離子的特征吸收(υCOO-), 1455 cm-1處應為飽和碳氫的彎曲振動吸收峰(δC-H)。綜上所述，本品既含有多糖的特征吸收(如較強的飽和碳氫吸收，標明應含有大量的飽和碳氫鍵，以及羥基的存在，均符合多糖的特征)，也有明顯的蛋白質分子的結構特征，如NH3+(偶極離子)和與之對應的COO-(羧酸根負離子)均顯示為氨基酸的特征吸收；羰基的存在，也印證了這個結論。因此，紅外分析結果和化學分析結果基本一致，證明本品中的主要成分應為多糖和蛋白質。

圖8 泥鰍活性物質的紅外圖譜(FT-IR Spectrum)

6 討論與結論

活性物質可能會隨泥鰍加工而遭到破壞，故采用冷凍干燥法，將其活性物質有效保存。由于泥鰍表皮特性柔軟，在粉碎過程中能較好地與其他組織(肌肉等)分離，而其表面的黏液等則可以固化在表皮表面，故采用65℃提取，以盡量保持活性物質的穩定。

1)單因素試驗、正交試驗結果顯示，泥鰍表皮活性物質提取最佳條件為：提取次數3次、提取溫度65℃、提取時間2 h、料液比1∶20。其提取率為8.52%。

2)泥鰍表皮活性物質主要為多糖(含量為25%)，蛋白質含量較低(含量為15%)。紅外圖譜表明，本品的主要構成應為氨基酸和多糖。

3)采用硫酸苯酚法測定泥鰍活性物質中的多糖含量，考馬斯亮藍法測定泥鰍活性物質中的蛋白質含量，測定方法操作簡便，結果準確，便于實際應用。

在下一步的研究中，會將蛋白質和多糖進行分離，對多糖進行進一步的鑒定，并比較泥鰍表皮中的蛋白質是否和肌肉組織中的蛋白質同源，為泥鰍中活性物質的研究提供進一步的證據。