冬凌草甲素通過下調lncRNA AFAP1-AS1表達對人乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用

李志明， 黃 勇， 龍 鳳,2*， 孫少康， 劉曉燕， 趙 玉

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

乳腺癌是女性最常見的癌癥之一，已成為世界第一大癌癥[1]。三陰性乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，由于其特殊的分子異質性及高侵襲性，目前藥物、手術效果均欠佳[2-5]，故明確本病內在分子機制，研發高效、低毒、可靶向性的抗癌新藥及藥物組合刻不容緩。冬凌草甲素是冬凌草的主要活性成分，多次被報道在乳腺癌中扮演抗癌角色，但其具體抗癌分子機制尚不明確。已有研究表明AFAP1-AS1在乳腺癌中高表達，患者具有較高的轉移和復發風險[6]，敲低AFAP1-AS1可通過影響上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關基因的表達來抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7]。lncRNA可充當microRNA(miRNA)海綿或競爭性內源RNA(ceRNA)，調控下游靶基因，影響癌細胞惡性生物學行為。因此，本研究觀察siRNA靶向沉默lncRNAAFAP1-AS1并聯合冬凌草甲素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲及EMT的影響，分析冬凌草甲素抗三陰性乳腺癌可能的ceRNA調控分子機制，旨在進一步揭示冬凌草甲素抗乳腺癌作用的新分子靶標，以期為以lncRNAAFAP1-AS1為靶點研發治療乳腺癌的靶向藥物及藥物組合提供藥理學依據和奠定科學理論基礎。

1 材料

1.1 細胞株 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自中國科學院上海細胞庫，編號TCHu227。

1.2 試劑與藥物 冬凌草甲素(批號3239848，純度94.2%)購自美國Merck公司。CCK-8試劑盒(批號LK811)購自日本同仁公司；Transwell小室(批號02920022)、Matrigel基底膠(批號9343008)購自美國Corning公司；riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒(批號S1230)、人屬AFAP1-AS1引物(批號T0814)、riboFECT CP Transfection Kit(批號T0915)、RiboTM h-AFAP1-AS1 Smart Silencer-2(批號T0824)、lncRNA Smart Silencer NC#1(批號T0710)購自廣州銳博生物技術有限公司；兔抗人GAPDH(批號YM3215)、Vimentin(批號YT4879)、E-cadherin(批號YT1454)、N-cadherin多克隆抗體(批號YT2988)，HRP標記山羊抗兔IgG二抗(批號RS002)均購自蘇州睿瀛生物技術有限公司；兔單克隆抗體CDC42(批號ab187643)購自英國Abcam公司；小鼠單克隆抗體MAP3K10(批號sc-393675)購自美國Santa Cruz公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗(批號CR2012171)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器 HERAcell VIOS 160i型CO2恒溫培養箱、Varioskan LUX型酶標儀(美國Thermo公司)；LightCycler?96型實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)；PowerPacTM Basic型電泳槽/電轉移裝置(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細胞培養 人乳腺癌MDA-MB-231細胞加到含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期者進行實驗。

2.2 細胞轉染及分組 采用riboFECTTM CP試劑盒、RiboTM lncRNA Smart Silencer試劑沉默MDA-MB-231細胞中AFAP1-AS1表達，由廣州銳博生物技術有限公司合成AFAP1-AS1 siRNA的靶序列和包括在人轉錄組中沒有靶標的siRNA作為非靶標對照(si-NC)。用riboFECTTM CP轉染試劑在6孔板中以30%～50%的細胞密度進行siRNA轉染，并孵育48 h。取對數生長期的MDA-MB-231細胞，以4 μg/mL冬凌草甲素處理的細胞作為冬凌草甲素組；將si-NC、si-AFAP1-AS1分別轉染至MDA-MB-231細胞中，作為siNC、siAFAP1-AS1組；將si-NC、si-AFAP1-AS1分別轉染至MDA-MB-231細胞中，再用4 μg/mL冬凌草甲素處理，分別作為siNC+冬凌草甲素、siAFAP1-AS1+冬凌草甲素組；對照組加入含或者不含有血清、0.1% DMSO的DMEM培養液。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力 以每孔3×103個細胞的密度接種到96孔培養板中，培養過夜后將細胞培養液更換為含有不同質量濃度冬凌草甲素(0、2、4、6、8 μg/mL，DMSO溶解)的新鮮培養基，分別培養24、48、72 h；或將細胞按“2.2”項下方法分組及給藥，培養48 h，加入CCK-8溶液，培養箱中繼續培養2 h，采用酶標儀在450 nm波長處檢測光密度(OD)值。對照孔細胞存活率為100%，計算各組細胞相對存活率。

2.4 RT-qPCR法檢測AFAP1-AS1 mRNA表達 收集各組細胞，采用RNAiso Plus試劑提取總RNA，超微量核酸蛋白測量儀在260 nm/280 nm波長處檢測RNA濃度。根據riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒說明書檢測各組細胞AFAP1-AS1 mRNA表達，反應條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，延伸30 s，共40個循環。AFAP1-AS1正向引物序列5′-CGGCATCCAACTCACAAGAC-3′，反向引物序列5′-GTCCTCTTCCCATGTGAGTCATC-3′，GAPDH內參引物由廣州銳博生物技術有限公司提供。采用2-ΔΔCT法分析AFAP1-AS1相對表達。

2.5 劃痕實驗 將各組細胞以每孔1×106個的密度接種于含完全培養基的6孔板中，待細胞生長至80%～90%后更換為不含血清的培養基培養12 h，200 μL槍頭在每孔中劃線，PBS洗去脫落的細胞，加入無血清的含藥或不含藥培養液，培養48 h，在倒置顯微鏡下觀察0、48 h劃痕愈合的情況，并計算遷移率。實驗重復3次。

2.6 Transwell侵襲實驗 將40 μL用DMEM稀釋后的基質膠均勻鋪在Transwell小室底部，在37 ℃下孵化過夜，將各組MDA-MB-231細胞密度調整為5×105/mL。Transwell上室加入100 μL細胞懸液，下室每孔加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，用棉簽拭子擦除小室上層未侵襲的細胞，4%福爾馬林固定膜下的細胞，0.1%結晶紫染色，在倒置顯微鏡下拍照計數。

2.7 Western blot法檢測CDC42、MAP3K10蛋白及EMT相關蛋白表達 取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，按“2.2”項下方法分組及給藥，培養48 h后收集細胞，采用高效RIPA裂解液裂解并提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度并定量。蛋白樣品加入4×蛋白上樣緩沖液，水浴加熱變性，保存備用。將各組蛋白加至PAGE膠中進行電泳，再移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉40 min，加入一抗GAPDH(1∶5 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 500)、CDC42(1∶10 000)、MAP3K10(1∶500)，在4 ℃下孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)或HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化學發光試劑盒和Western印跡成像系統檢測目標條帶灰度，以GAPDH為內參蛋白，計算目的蛋白相對表達。

3 結果

注：與正常組織比較，**P<0.01；與AFAP1-AS1低表達組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.1 lncRNAAFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中高表達并與乳腺癌患者不良預后有關 分別通過GEPIA2和lnCAR database在線工具分析AFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中的表達，結果如圖1A～1B所示，可知AFAP1-AS1在正常乳腺組織和三陰性乳腺癌組織中差異性表達(P<0.01)；與正常乳腺組織比較，AFAP1-AS1在三陰性乳腺癌組織中高表達(P<0.01)。為了進一步探討AFAP1-AS1在乳腺癌患者中的預后意義，通過lnCAR database在線工具“survival analysis模塊”分析AFAP1-AS1表達與乳腺癌患者總生存期和無復發生存期的相關性，結果如圖1C～1D所示，與AFAP1-AS1低表達的乳腺癌患者比較，AFAP1-AS1高表達的乳腺癌患者的生存期降低(P<0.05，P<0.01)。

3.2 冬凌草甲素調控lncRNAAFAP1-AS1表達對MDA-MB-231細胞增殖的影響 如表1所示，與對照組比較，冬凌草甲素組細胞存活率降低，并呈現時間和劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)。如表2所示，與對照組比較，冬凌草甲素下調了MDA-MB-231細胞中AFAP1-AS1 mRNA表達(P<0.05)。

如表3所示，與si-NC組比較，沉默AFAP1-AS1表達后，細胞存活率降低(P<0.01)，siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯合使用對MDA-MB-231細胞活力的抑制作用比單獨應用siAFAP1-AS1或冬凌草甲素更為明顯(P<0.01)。

表1 冬凌草甲素對MDA-MB-231細胞存活率的影響

表2 冬凌草甲素或siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞AFAP1-AS1 mRNA表達的影響

表3 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞存活率的影響

3.3 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響 如圖2、表4所示，與si-NC組比較，siAFAP1-AS1組細胞相對遷移率、侵襲細胞數均降低(P<0.05)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯合使用對細胞遷移、侵襲的抑制作用比單獨應用siAFAP1-AS1或冬凌草甲素更顯著(P<0.01)。

圖2 各組MDA-MB-231細胞遷移(A)和侵襲(B)能力(×200)

表4 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響

3.4 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞中EMT相關蛋白表達的影響 如圖3、表5所示，與對照組比較，冬凌草甲素組和siAFAP1-AS1組細胞E-cadherin蛋白表達均升高(P<0.05，P<0.01)，N-cadherin和Vimentin蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯合使用上調E-cadherin蛋白表達，下調N-cadherin和Vimentin蛋白表達的作用比單獨應用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1更顯著(P<0.01)。

圖3 各組MDA-MB-231細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達

3.5 基于生物信息學分析lncRNAAFAP1-AS1的靶基因 在線數據庫ENCORI、DIANA-LncBasev.2預測與AFAP1-AS1相互作用的microRNA，取交集篩選出2個候選miRNA(圖4A)為miR-2278、miR-155-5p。有研究報道，miR-155-5p是三陰性乳腺癌中差異上調的miRNA且miR-155-5p和AFAP1-AS1之間存在互補位點[8-9]。通過在線數據庫ENCORI、miRDB和TargetScan7.2預測miR-155-5p的靶基因，共找到包括絲裂原活化蛋白激酶激酶10(MAP3K10)在內的220個靶基因(圖4B)。通過Bioconductor在線軟件對220個靶基因進行GO(圖4C)和KEGG信號通路(圖4D)分析，發現其共同靶點主要富集于DNA結合轉錄激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結合、鈣黏蛋白結合和細胞粘附分子結合等關鍵生物過程；主要富集于多種癌癥通路，MAPK、PI3K-Akt和催乳素信號通路。

表5 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞EMT相關蛋白表達的影響

圖4 生物信息學分析

3.6 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達的影響 如圖5、表6所示，與對照組比較，冬凌草甲素和siAFAP1-AS1均可下調CdC42、MAP3K10蛋白表達(P<0.05，P<0.01)；siAFAP1-AS1和冬凌草甲素聯合使用對細胞CdC42、MAP3K10蛋白表達的抑制作用比單獨應用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1更顯著(P<0.01)。

圖5 各組MDA-MB-231細胞中Cdc42、MAP3K10蛋白表達

4 討論

目前已證實lncRNA作為新功能調控分子，參與多種惡性腫瘤發生、發展過程[10-11]。一項薈萃分析顯示，AFAP1-AS1在多種癌癥中均上調，AFAP1-AS1高表達與不良的臨床結果(如淋巴結轉移和遠處轉移)密切相關并參與腫瘤進展[12]。

表6 冬凌草甲素和siAFAP1-AS1對MDA-MB-231細胞Cdc42、MAP3K10蛋白表達的影響

本研究通過在線數據庫分析，進一步證明了AFAP1-AS1過表達與乳腺癌患者總生存期和無復發生存期呈負相關。冬凌草甲素被報道可下調人胰腺癌BxPC-3和PANC-1細胞中AFAP1-AS1的表達[13]。本研究發現，與對照組比較，冬凌草甲素可下調細胞中AFAP1-AS1表達，與報道一致，結果表明AFAP1-AS1可能是冬凌草甲素治療乳腺癌的潛在分子靶標。

本研究探討了冬凌草甲素聯合siAFAP1-AS1對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的影響，結果表明，冬凌草甲素組和siAFAP1-AS1組細胞活力、遷移率和侵襲率均降低，且聯合使用對細胞抑制作用更顯著。EMT是腫瘤遷移的早期事件，它與細胞間連接的結構變化有關，對癌細胞遷移至關重要，本研究結果表明，與單獨應用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1比較，冬凌草甲素聯合siAFAP1-AS1可降低EMT相關標記蛋白N-cadherin、Vimentin蛋白表達，升高E-cadherin蛋白表達，提示冬凌草甲素聯合siAFAP1-AS1治療乳腺癌可獲得更佳的抗癌療效。

研究表明lncRNA參與ceRNA-miRNA-mRNA調控網絡，它維持調控癌細胞中基因通路的活性和功能平衡[14-15]。本研究通過在線數據庫分析共找到包括MAP3K10在內的220個靶基因，而MAPK為顯著性富集的信號通路之一。MAP3K10是MAPK信號通路關鍵調控分子，可通過激活MKK4和MKK7激活JNK通路，參與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學過程[16-17]。研究發現，MAP3K10在胰腺導管腺癌組織和細胞系中表達上調，MAP3K10過表達促進胰腺癌細胞增殖[18]。細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42, Cdc42)是MAP3K10上游的信號分子，參與調節腫瘤細胞遷移和侵襲、上皮間質轉化、細胞周期進程和腫瘤血管生成等[19]。在乳腺癌中，Cdc42能夠與下游效應蛋白相互作用，抑制表皮生長因子受體降解，從而使MAPK被持續激活，最終造成腫瘤細胞的增殖、轉移[20]。因此，推測Cdc42/MAP3K10可能作為AFAP1-AS1靶點參與冬凌草甲素和siAFAP1-AS1抑制MDA-MB-231細胞惡性生物學行為的作用。本研究發現，單獨應用冬凌草甲素或siAFAP1-AS1均可下調MDA-MB-231細胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達；聯合使用對細胞中CDC42、MAP3K10蛋白表達的抑制作用更顯著，提示冬凌草甲素和 siAFAP1-AS1對Cdc42/MAP3K10信號通路存在一定的抑制作用。

綜上所述，冬凌草甲素對MDA-MB-231細胞生長、遷移和侵襲的抑制作用可能是通過下調AFAP1-AS1表達進而抑制Cdc42/MAP3K10信號通路實現的。此實驗結果為冬凌草甲素應用于乳腺癌的治療提供了新的藥理學依據，為以lncRNAAFAP1-AS1為靶點研發治療乳腺癌的靶向藥物及藥物組合提供了可能。