甘草對5種病毒的抑制作用及抗RSV活性部位的篩選

李忠原， 李保宏， 劉苗苗， 楊 穎， 田景振,2 *， 崔清華

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學青島中醫藥科學院，山東 青島 266041；3.山東中醫藥大學中醫藥創新研究院，山東 濟南 250355)

甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖，相關產品在國內外均占有重要份額[1]，其化學成分以三萜皂苷類和黃酮類為主[2]，具有抗潰瘍、抑菌、抗炎、解痙、降血脂、鎮痛、抗心律失常、抗腫瘤、抗病毒等作用[3-4]。目前，國內外大量報道顯示甘草具有廣譜抗病毒的潛力，如甘草水提物可抑制H3N2型流感病毒[5]，甘草水提物與水提醇沉后的沉淀可抑制呼吸道合胞病毒(RSV)[6-7]，甘草皂苷類成分可抑制H1N1型流感病毒[8-9]，甘草酸可作用于新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)刺突蛋白發揮抗病毒作用[10]并抑制腸道病毒71型(EV71)[11-12]、乙型肝炎病毒(HBV)[13]、丙型肝炎病毒(HCV)[14]。本實驗研究甘草對RSV、1型單純皰疹病毒(HSV-1)、腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒B3(CV-B3)、柯薩奇病毒B5(CV-B5)的體外抗病毒效果，豐富了該藥材抗病毒譜。另外，甘草可歸肺經，而RSV可經呼吸道感染人體造成病毒性肺炎，并且甘草對其作用效果最強，故本實驗又篩選了相關活性部位，并通過體內外實驗初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 甘草購自亳州中強中藥飲片有限公司(產地新疆和田，批號191101)，經山東中醫藥大學徐凌川教授鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。利巴韋林(批號807A021)、阿昔洛韋(批號1023A021)(北京索萊寶科技有限公司)。胎牛血清(批號42A0378K)、DMEM細胞培養液(批號8120010)、磷酸鹽緩沖液(批號8120150)、0.25% EDTA胰酶(批號1951208)(美國Gibco公司)；青鏈霉素混合液(北京白鯊易科技有限公司，批號70011000)；二甲亞砜(DMSO，美國Amresco公司，批號821D035)；噻唑藍染液(美國VWR公司，批號1636C097)；Nrf2試劑盒(批號B06011498)、NF-κB p105試劑盒(批號B07011499)、Keap1試劑盒(批號A16019408)(武漢華美生物工程有限公司)；TLR4試劑盒(批號12/2020)、TNF-α試劑盒(批號12/2020)、IFN-β試劑盒(批號12/2020)(上海酶聯生物科技有限公司)。

1.2 宿主細胞及病毒毒種 非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)、人喉癌上皮細胞(Hep2細胞)購自上海生博生物醫藥科技有限公司；RSV、HSV-1、EV-71、CV-B3、CV-B5由山東省醫學科學院基礎醫學研究所提供，保存于山東中醫藥大學藥學院實驗室。

1.3 動物 4周齡BALB/c雌性小鼠40只，體質量12～14 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2016-0006，實驗動物使用許可證號SYXK(魯)2017-0022。

1.4 儀器 Spectra Max M5型酶標儀(美國Molecular Device公司)；HFsafe-1200TE型生物安全柜、HF90型CO2細胞恒溫培養箱(上海力申科學儀器有限公司)；TDD5M型臺式平衡離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實業有限公司)；ALPHA 1-4 LD plus型冷凍干燥機(德國Christ公司)；CKX-31型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 供試品制備

2.1.1 甘草水提物 取200 g藥材洗凈，加12倍量水浸泡30 min，加熱回流提取90 min，共2次，藥液離心過濾，濃縮至原藥材1 g/mL，冷凍干燥，即得。體外實驗所用水提物粉末以含2% FBS的DMEM培養液配制成10 mg/mL溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃下冷藏備用。

2.1.2 不同溶劑萃取部位 取藥材200 g洗凈，按“2.1.1”項下方法提取濃縮，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～5次至有機層幾乎無色，將各部分萃取液分別濃縮、減壓干燥至干粉狀，并以含2% FBS的DMEM培養液配制成6 mg/mL(正丁醇、水部位)、0.6 mg/mL(石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯部位)溶液(輔以1% DMSO助溶)，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得，4 ℃下冷藏備用。

2.2 體外抗病毒作用研究

2.2.1 細胞培養與復蘇 液氮罐中取出保存的細胞，在37 ℃下迅速融化，于生物安全柜中將其懸液轉移至無菌離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入新的細胞培養液，吹打細胞，將混懸液轉移至細胞培養皿中，于CO2細胞培養箱(溫度37 ℃、5% CO2、相對濕度75%)中培養，6 h后換液，繼續培養待單層細胞80%匯合時，以1∶3比例傳代培養。

2.2.2 病毒擴增 待細胞匯合至70%左右時，棄去原培養液，PBS清洗去除細胞碎片，加入0.2 mL病毒液(RSV、HSV-1、EV71、CV-B3、CV-B5)，輕搖培養皿使病毒與細胞充分接觸，于CO2細胞培養箱中培養，每15 min輕搖培養皿，2 h后棄去培養液，清洗后加入10 mL含2% FBS的DMEM培養液，每天鏡檢觀察病變，48 h后停止培養，病毒組培養皿密封反復凍融3～4次，將病毒液轉移至無菌離心管中，3 000 r/min離心3 min，取上清液分裝，在-80 ℃下保存備用。

2.2.3 病毒毒力測定 將細胞以每孔1×104個的密度接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2下培養12 h。取“2.2.2”項下病毒液按10倍比稀釋8個濃度，加于單層細胞中培養48 h，每個病毒稀釋度重復6個孔，細胞病變效應法(CPE)觀察感染情況，按照Reed-Muench公式計算各病毒滴度TCID50。

2.2.4 藥物細胞毒性測定 將細胞以每孔1×104個的密度接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2下培養12 h，將“2.1”項下供試液按2倍比稀釋8個質量濃度后加入到細胞中，設置3個復孔，并設細胞對照組、空白對照組，于培養箱中培養48 h，CPE法觀察感染情況，用MTT法檢測細胞活性，采用酶標儀于490 nm處檢測光密度(OD)值，通過GraphPad Prism 5軟件擬合藥物CC50。

2.2.5 藥物抗病毒活性測定 細胞按“2.2.4”項下方法培養，并以100 TCID50/孔的病毒感染細胞，設置3個復孔，并設細胞對照組、病毒對照組、空白對照組，于培養箱中培養48 h，CPE法觀察感染情況，MTT法檢測細胞活性，采用酶標儀于490 nm處檢測OD值，通過GraphPad Prism 5軟件擬合藥物EC50。

2.3 加時實驗 為了研究甘草活性部位作用在RSV復制周期的具體階段，故又進行了加時實驗[15]。實驗前24 h，將Hep2細胞以每孔8×104個的密度接種于24孔板，設置空白對照組、藥物干預組，每種藥物[甘草正丁醇部位萃取物(0.3 mg/mL)、甘草水部位(3 mg/mL)、利巴韋林(100 μmol/L)]分為8份，分別在-2、0、2、4、6、8、12、16 h時加入，每個時間點重復3孔，在0 h時棄去原培養液，加入新的冷培養液，以感染復數(MOI)為3的病毒量在4 ℃下感染細胞2 h，隨后用冷PBS洗滌細胞3次，加入新培養液，于細胞培養箱中培養，于20 h時收集上清液，按“2.2.3”項下方法檢測上清液病毒毒力。

2.4 甘草體內抗RSV作用研究

2.4.1 造模及給藥 將小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為空白組、模型組、利巴韋林(陽性藥，36 mg/kg)組、甘草正丁醇部位(30 mg/kg)組，適應性飼養3 d后每天灌胃相應藥物(0.1 mL/只)，空白組、模型組灌胃等體積生理鹽水。在給藥第1天用乙醚麻醉小鼠，滴鼻給予病毒(100 μL/只，滴度為3.4×107TCID50/mL)，連續2 d，空白組滴鼻給予等體積對照培養液。

2.4.2 樣品處理與指標檢測 按照預定方案給藥4 d，在第5天給藥1 h后，小鼠眼球取血，脫頸處死，解剖取肺組織，稱定質量，計算肺指數，再用4%甲醛固定，經脫水、組織透明、浸蠟、包埋、切片、烘干后，HE染色以觀察肺部病變。將小鼠全血于4 ℃下過夜，在4 ℃、3 000 r/min下離心20 min，取上清，ELISA法檢測血清TLR4、NF-κB、TNF-α、IFN-β、Keap1、Nrf2水平。

3 結果

3.1 病毒毒力 如表1所示，HSV-1、EV71以Vero細胞為宿主細胞，RSV、CV-B3、CV-B5以Hep2細胞為宿主細胞。

3.2 抗病毒譜 如表2所示，甘草水提物對5種病毒均有較好的抑制作用，其中對RSV效果最強。

3.3 甘草抗RSV活性部位篩選 如圖1所示，甘草正丁醇部位活性最強，TI值為36.22；其次是水部位，TI值>15.71。

圖1 活性部位的篩選

3.4 加時實驗 如圖2A所示，陽性藥利巴韋林在6～10 h時對RSV具有一定的抑制作用，主要是在復制階段，而在-2～6 h時作用較差。如圖2B所示，甘草正丁醇部位在-2～4、6～12 h時對RSV具有一定的抑制作用，12 h后逐漸減弱，主要是在吸附、復制階段，而在穿入階段不明顯，呈現出藥物預防效果。如圖2C所示，甘草水部位在-2～8 h時對RSV具有一定抑制作用，8 h后逐漸減弱，主要是在吸附、復制階段，呈現出藥物預防、抑制病毒穿入效果。

注：-2 h處的點表示藥物作用在-2～0 h，0 h處的點表示藥物作用在0～2 h，2 h及2 h以后的點均表示藥物作用在該點至20 h。若2 h之后某兩點的滴度相同，則表示在這段時間內藥物對病毒沒有抑制作用。

3.5 甘草正丁醇部位抗RSV作用及其機制

3.5.1 對病理形態的影響 如圖3所示，模型組小鼠肺泡壁增厚，多數肺泡腔變小或幾乎看不見，肺泡腔內及肺間質有明顯出血，伴有炎性細胞浸潤；空白組小鼠肺泡結構清晰，肺泡腔內未見滲出物，未見炎性細胞浸潤；甘草正丁醇部位組小鼠肺泡壁增生情況得到改善，肺泡形態趨于正常肺泡腔出血情況減輕，炎性細胞浸潤情況減輕；利巴韋林組小鼠肺泡壁較模型組得到改善，肺泡腔及肺間質出血情況得到改善，炎性細胞浸潤情況減輕。

圖3 甘草正丁醇部位對小鼠肺組織病理變化的影響(HE，×200)

3.5.2 對肺指數的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組小鼠肺指數升高(P<0.01)，提示造模成功；與模型組比較，甘草正丁醇部位組和利巴韋林組小鼠肺指數均降低(P<0.05)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

3.5.3 對炎癥及免疫反應相關因子的影響 如圖5所示，與模型組比較，甘草正丁醇部位可降低小鼠血清TLR4水平(P<0.05)；甘草正丁醇部位和利巴韋林可降低小鼠血清NF-κB及TNF-α水平(P<0.05)，升高IFN-β水平(P<0.05)。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

3.5.4 對氧化應激通路的影響 如圖6所示，與模型組比較，甘草正丁醇部位可降低小鼠血清Keap1水平(P<0.05)，甘草正丁醇部位和利巴韋林均可升高血清Nrf2水平(P<0.01)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

本實驗首先考察了甘草水提物對RSV、HSV-1、EV71、CV-B3、CV-B5的體外抗病毒作用，結果顯示其對以上5種病毒均有一定程度的體外抗病毒作用，其中抗RSV的效果最好。然后對甘草抗RSV的活性部位進行研究，發現甘草抗RSV的有效部位是正丁醇與水部位，結果提示甘草抗RSV的活性成分可能是極性相對較大的成分，如多糖、皂苷、黃酮類等成分。進一步研究了甘草正丁醇部位和水部位抗RSV的初步機制，陽性藥利巴韋林主要作用在病毒的復制階段，甘草正丁醇部位、水部位在RSV復制周期針對多個階段(吸附、穿入、復制)具有抑制RSV的作用，后續需針對不同的作用階段尋找其抑制RSV的作用通路進行深入研究。

病毒入侵機體后可造成組織的氧化應激損傷以及一系列的炎癥損傷。TLR4是連接固有免疫與炎癥的橋梁，宿主的TLR4可識別RSV的F蛋白，在TLR4信號傳導中進一步激活NF-κB通路，進而誘導炎癥因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)的表達，促進炎癥反應[16]。干擾素(IFN)是機體所產生的具有廣譜抗病毒作用的一種細胞因子，RSV的G蛋白可抑制IFN-β的表達進而促進RSV的免疫逃逸[17]。Cuadrado等[18]提出Nrf2可作為呼吸道病毒疾病治療的潛在靶點，在生理條件下，Nrf2與Keap1偶聯于細胞質中，應激狀態下Nrf2從胞漿解離至細胞核內并促進抗氧化基因的表達，Nrf2和NF-κB存在功能性的相互作用，Nrf2的降低會加劇NF-κB的活性，Nrf2的激活可促進炎癥的緩解。甘草體內抗RSV實驗結果提示，甘草正丁醇部位可以提高感染RSV小鼠血清IFN-β水平，抑制RSV的免疫逃逸；通過抑制TLR4/NF-κB通路并降低TNF-α水平，抑制RSV所引起的肺部炎癥反應；并且可以通過Keap1/Nrf2通路降低小鼠的氧化應激水平從而改善RSV引起的小鼠肺組織損傷。

中藥抗病毒的特點是多成分、多靶點的協同作用，關于中藥的抗病毒作用可從抑制病毒、炎癥反應、免疫調節等方面進行綜合評價[19]。本實驗通過抑制病毒、炎癥反應、免疫調節、氧化應激方面，對甘草體內外抗病毒作用進行了初步研究，為后續深入的機制研究及活性物質基礎的尋找奠定一定基礎。