金鐵鎖提取物對類風濕性關節炎小鼠滑膜組織自噬與凋亡的研究

韋迎春 錢子剛 普元柱崔萌 周興悅 郭榮伶 陳海豐

（云南中醫藥大學， 云南 昆明650500）

類風濕性關節炎是一種慢性自身免疫性疾病，主要病理特征為炎癥反應、滑膜增生、關節軟骨和骨破壞等［1］，全球發病率達1%［2］。研究表明，自噬在機體中的失衡與類風濕性關節炎息息相關［3］。一般情況下，自噬作為機體的保護機制可減輕抗原微生物、異常蛋白等產生的危害，但有研究發現，在類風濕性關節炎患者的滑膜細胞中存在高水平自噬，從而導致滑膜細胞抗凋亡，異常增殖的滑膜細胞侵襲軟骨及骨組織導致持續炎癥和關節損傷［4］。因此，降低滑膜細胞的自噬水平將是研究類風濕性關節炎治療機制的重要方向。

中醫根據類風濕性關節炎的病因病機將其歸屬于“痹癥”范疇，治療原則為祛風除濕，散寒止痛［5］。石竹科植物金鐵鎖首載于《滇南本草》，具有祛風除濕、散瘀止痛、解毒消腫之功，作用于風濕痹痛，跌打損傷等病癥［6］，臨床上金鐵鎖在許多具有消炎止痛功效的中成藥中發揮重要作用［7］。現代藥理研究發現，金鐵鎖治療類風濕性關節炎的機制可能與其抗炎鎮痛、調節免疫的作用有關［8］。本研究將通過探究金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠滑膜組織中細胞自噬與細胞凋亡的影響，為金鐵鎖治療類風濕性關節炎的作用機制提供新的實驗依據。

1 材料

1.1 動物 100 只清潔級雄性C57BL／6 小鼠，7～8 周齡，體質量15～18 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（湘）2019?0004。小鼠飼養于云南中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號SYXK（滇）2017?0005，小鼠適應性飼養7 d 后開始實驗。本實驗經云南中醫藥大學動物實驗中心倫理委員會審查合格（編號R?06202043）。

1.2 試劑與藥物 金鐵鎖，購自云南綠生中草藥開發有限公司，經云南中醫藥大學楊竹雅副教授鑒定為石竹科植物金鐵鎖Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu 的干燥根。硫酸羥氯喹片（自噬抑制劑，批號191070）購自上海上藥中西制藥有限公司；雞Ⅱ型膠原（批號190463）、弗氏完全佐劑（批號200262）均購自美國Chondrex 公司；caspase?3 多克隆抗體（批號20657?1?AP）、LC3 多克隆抗體（批號14600?1?AP）、Beclin?1 多克隆抗體（批號11306?1?AP）、P62／SQSTM1 多克隆抗體（批號18420?1?AP）、β?actin 單克隆抗體（批號66009?1?lg）、GAPDH 單克隆抗體（批號66004?1?lg）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號SA00001?2）、辣根過氧化物 酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG 二抗（批號SA00001?1）均購自美國Proteintech 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010）購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 儀器 Axio Vert.A1 型倒置顯微鏡購自德國蔡司公司；DYY?6D 型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；Chemstud 型多功能分子凝膠成像系統購自德國耶拿公司；組織高速冷凍勻漿機購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Spark10M 型酶標儀購自帝肯（上海）貿易有限公司；SW?CJ?1D 型超凈工作臺購自上海昕儀儀器儀表有限公司；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機購自力康生物醫療科技控股有限公司。

2 方法

2.1 金鐵鎖提取物制備 稱取適量金鐵鎖干燥粉末，加5倍量75%乙醇回流提取3次，濾過，合并濾液，濃縮，回收乙醇，即得金鐵鎖提取物，出膏率為0.387 9%。給藥前用生理鹽水稀釋至低、高劑量（75.65、302.60 mg／kg），相當于臨床等效劑量、4 倍劑量。

2.2 造模、分組及給藥 每只小鼠尾根部皮下注射0.1 mL雞Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等比混合乳劑（每0.1 mL 含100 μg 膠原），記為首次免疫，首次免疫第21天，以相同方法進行二次加強免疫［9?10］。二次免疫后第16天，將造模成功的小鼠隨機分為模型組、羥氯喹組（52 mg／kg）及金鐵鎖低、高劑量組（75.65、302.60 mg／kg），每組10只，另取未造模的10 只小鼠作為正常組。分組后當天開始給藥，給藥組灌胃給予相應劑量藥物，正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，連續21 d。

2.3 小鼠關節炎損傷程度評價

2.3.1 關節炎指數評分 致炎后，每隔3 d 對小鼠后肢進行關節炎評分，記錄關節炎病變程度。評分標準［11］為0分，無明顯紅腫；1分，踝、腕關節或單個足趾輕度紅腫；2分，踝或腕關節中度紅腫；3分，整個足包括足趾嚴重紅腫；4分，四肢嚴重發炎，多關節受累病變。

2.3.2 足腫脹度檢測 使用排水容積法測量各組小鼠左右后足足跖容積，以小鼠造模前后足跖容積差度指示小鼠足跖的炎癥程度。足腫脹率＝［（致炎后足跖平均容積?致炎前足跖平均容積）／致炎前足跖平均容積］ ×100%。

2.3.3 關節病理組織學檢查 將右后肢標本在10%中性福爾馬林中固定24 h，經EDTA 脫鈣后包埋在石蠟中，切成5 μm厚的組織切片，進行HE 及番紅O?固綠染色，在100倍光學顯微鏡下觀察關節組織病理變化。

2.4 TUNEL 法檢測小鼠關節組織細胞凋亡情況 組織切片轉移至二甲苯中脫蠟，并在乙醇中水化，然后用50 μL蛋白酶?K 溶液覆蓋樣品，室溫下培養15～30 min，根據試劑盒說明書進行TUNEL 染色，于在高倍鏡下（×400）對至少有100 個細胞的3 個隨機視野進行觀察，計算TUNEL陽性細胞的百分比。

2.5 Western blot 法檢測小鼠滑膜組織中自噬和凋亡相關蛋白表達 稱取適量小鼠滑膜組織，加RIPA 裂解液進行勻漿，提取總蛋白，蛋白定量后加樣，恒壓電泳，濕轉法轉膜，含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h，TBST 洗滌，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入二抗（辣根過氧化物酶標記）室溫孵育2 h，TBST 洗滌，加入ECL 化學發光顯影液顯色，暗室曝光，拍照，使用Image J 軟件對圖像的灰度值進行分析。

2.6 免疫熒光共聚焦檢測LC3、p62 蛋白表達 制備小鼠關節切片，待切片干燥，滴加破膜工作液，室溫放置20 min，PBS 洗滌，滴加3%牛血清蛋白封閉液，室溫封閉30 min，甩掉封閉液，滴加PBST 稀釋的一抗，于濕盒中4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌，滴加熒光標記二抗，室溫避光孵育60 min，PBST 洗滌，滴加DAPI 染液復染核，室溫避光孵育15 min，PBST 洗滌，稍甩干玻片，滴加抗熒光淬滅封片液封片，于光學顯微鏡下觀察LC3、p62 蛋白熒光強度。

2.7 統計學分析 通過GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行處理，數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠關節炎指數評分的影響 二次免疫后，小鼠的踝關節、足跖多關節逐漸出現明顯紅腫，16 d 時模型組小鼠關節炎指數評分均大于4分，表明造模成功［12］，且正常組小鼠均無關節炎癥狀。如表1 所示，除正常組外，各組小鼠關節炎指數評分逐漸升高，在21 d 達到峰值后開始降低。與模型組比較，29 d后羥氯喹組關節炎指數評分降低（P＜0.01），33 d 后金鐵鎖各劑量組和羥氯喹組關節炎指數評分均降低（P＜0.01）。

表1 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠關節炎指數評分的影響（分，，n＝10）

表1 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠關節炎指數評分的影響（分，，n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.2 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠足腫脹的影響 二次免疫當日測量小鼠左右后足足跖容積作為致炎前足跖容積，致炎前各組小鼠足跖容積比較無差異（P＞0.05）。實驗期間正常組小鼠足跖容積未發生明顯變化（P＞0.05），提示正常組小鼠未出現足腫脹病變。與正常組比較，16 d 后模型組小鼠足腫脹度升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，金鐵鎖高劑量組給予藥物干預21 d 后抑制了小鼠足腫脹度（P＜0.05，P＜0.01），33 d 后金鐵鎖各劑量組和羥氯喹組小鼠足腫脹度降低（P＜0.01），見表2。

表2 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠左右后足足腫脹度的影響（%，，n＝10）

3.3 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠關節病理組織學損傷程度的影響 如圖1 所示，正常組小鼠關節面平滑，軟骨及骨組織無明顯損傷，無明顯炎性細胞浸潤；模型組小鼠關節組織滑膜成纖維細胞增生，滑膜組織增厚，炎性細胞浸潤較為嚴重，關節面出現明顯損傷導致關節面不平滑，軟骨細胞（紅色）明顯增加，符合類風濕性關節炎的基本病理學特征，表明膠原誘導的關節炎小鼠模型造模成功；金鐵鎖各劑量組小鼠關節組織炎性細胞浸潤明顯減少，正常組增加但較模型組減少。提示，金鐵鎖提取物對小鼠關節及軟骨有一定的保護作用，可有效緩解類風濕性關節炎病癥。

圖1 各組小鼠關節組織切片病理變化（×100）

3.4 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠關節滑膜組織細胞凋亡的影響 如圖2 所示，與正常組比較，模型組小鼠關節滑膜組織中滑膜細胞陽性染色（棕色）細胞減少；與模型組比較，羥氯喹組小鼠關節滑膜細胞凋亡陽性率增加（P＜0.05），金鐵鎖各劑量組小鼠關節滑膜細胞凋亡陽性率增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。提示，模型小鼠關節滑膜細胞凋亡受到抑制，而藥物干預后細胞凋亡增加。

圖2 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠滑膜組織細胞凋亡的影響（，n＝10）

3.5 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠滑膜組織中自噬及凋亡相關蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠滑膜組織Beclin?1、Bcl?2 蛋白表達和LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值升高（P＜0.05，P＜0.01），p62、caspase?3 蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組和金鐵鎖高劑量組小鼠滑膜組織Beclin?1 蛋白表達降低（P＜0.05），caspase?3 蛋白表達升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），金鐵鎖各劑量組p62 蛋白表達升高（P＜0.05），金鐵鎖高劑量組Bcl?2 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 金鐵鎖對膠原誘導的關節炎小鼠滑膜組織中自噬及凋亡相關蛋白表達的影響（，n＝10）

3.6 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠滑膜組織中LC3、p62 蛋白表達的影響 如圖4 所示，與正常組比較，模型組小鼠滑膜組織LC3 蛋白表達增加（P＜0.05），而p62蛋白表達減少（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組和金鐵鎖各劑量組小鼠滑膜組織LC3、p62 熒光強度均增強（P＜0.05），提示小鼠滑膜組織中LC3 與p62 蛋白表達增加。

圖4 金鐵鎖提取物對膠原誘導的關節炎小鼠滑膜組織中LC3、p62 蛋白表達的影響（，n＝10）

4 討論

在類風濕性關節炎的發病機制中，滑膜細胞的持續異常增殖與滑膜組織增厚、持續炎癥等密切相關。因此，促進滑膜細胞凋亡成為研究類風濕性關節炎治療機制的關鍵途徑之一［13］。本研究發現，金鐵鎖提取物干預后小鼠滑膜組織細胞凋亡增加，滑膜增生、軟骨損傷與炎性細胞浸潤等情況得到改善。

越來越多研究表明，自噬在類風濕性關節炎的發病過程中不僅參與了炎癥反應，對細胞凋亡也具有一定的調控作用，是重要的作用靶點之一［14?16］。當自噬被激活，上游信號啟動，磷酸化自噬標志蛋白Beclin?1 誘導細胞自噬的發生［17］。Beclin?1 激活后，從Beclin?1／Bcl?2復合物中分離，重新形成Beclin?1／VPS34 復合物促進自噬體的形成［18?19］。本研究發現，金鐵鎖提取物有效抑制了小鼠滑膜組織中Beclin?1 和Bcl?2 蛋白表達，上調了caspase?3 蛋白表達。提示，金鐵鎖提取物可能通過靶向Beclin?1／Bcl?2 復合物，干擾Beclin?1 與Bcl?2 的相互作用，抑制自噬體的形成，對自噬和凋亡起到調控作用。

在自噬體形成后期，LC3 被Atg4 切割，LC3Ⅰ轉化為LC3Ⅱ后定位到自噬體膜上。LC3Ⅱ可以穩定標示自噬小體的形成，是最常用的自噬特異性標志物，自噬體成熟后與溶酶體結合，進一步降解其內容物，因此，常以LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值與自噬底物p62 表達共同指示自噬通量［20］。通常LC3Ⅱ／LC3Ⅰ上調提示自噬小體形成增加，自噬的降解伴隨著p62 表達的下降。如果自噬溶酶體降解受到抑制，也會導致p62 的積累［21?22］，自噬抑制劑羥氯喹正是通過阻斷自噬體的降解抑制自噬［23］。本實驗結果顯示，金鐵鎖提取物可能發揮著類似于羥氯喹的作用，通過抑制自噬體的降解，降低自噬水平，從而改善小鼠關節炎癥。有研究表明，自噬?溶酶體途徑和泛素?蛋白酶體途徑共同擔負著細胞內降解錯誤折疊蛋白的職責，當其中一條途徑受到抑制，另一條途徑活性會代償性增加，以維持機體內平衡［24?25］。因此，金鐵鎖提取物對自噬?溶酶體途徑的影響是否也影響著泛素?蛋白酶體途徑，還需要進一步實驗證明。

綜上所述，本實驗證實金鐵鎖提取物治療類風濕性關節炎的藥效機制可能是通過抑制自噬體的形成，抑制自噬體降解，下調自噬水平，同時促進滑膜組織中細胞凋亡，從而改善滑膜異常增生及滑膜增生引起的炎癥及軟骨損傷。