滋腎育胎丸聯合二甲雙胍對腎虛型多囊卵巢綜合征大鼠的改善作用

何嘉侖 吳曉貞 張毅靖 甘劍峰 唐洪梅?

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院， 廣東 廣州510405； 2.廣州中醫藥大學， 廣東 廣州510405）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是以長期無排卵、高雄激素血癥、和／或胰島素抵抗為基本特征，具有發病多因性、生理病理和臨床表現多態性［1］，是導致育齡婦女月經異常、不孕的內分泌代謝紊亂性疾病，而高雄激素血癥是育齡期女性最常見的內分泌疾病［2］。PCOS 是婦科臨床疑難病證，影響約10% 育齡婦女［3］，屬中醫“閉經”“不孕”“癥瘕”等范疇［4］。滋腎育胎丸是著名中醫學家羅元愷教授的經驗方，對腎虛型PCOS 不孕患者具有改善中醫證候及激素水平，提高促排卵效果及妊娠率的作用［5］。滋腎育胎丸治療PCOS 常與二甲雙胍聯合用藥，而二甲雙胍作為PCOS 治療的輔助用藥可改善肥胖、多毛等癥狀，在改善高胰島素血癥的同時，降低女性體內的高雄激素，促進優勢卵泡發育及排出［6?7］。本研究通過探討滋腎育胎丸聯合二甲雙胍對腎虛型PCOS 大鼠模型的作用，及其對血管內皮生長因子（VEGF）及高遷移率族蛋白1（HMGB1）信號通路的影響，以期為深入探討滋腎育胎丸治療腎虛型PCOS 不孕患者的機理提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 50 只SPF 級SD 雌性大鼠，6 周齡，體質量120～140 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（粵）2018?0002。

1.2 試劑與藥物 滋腎育胎丸（批號A01007），購自廣州白云山中一藥業有限公司。鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊（批號20012021），購自北京圣永制藥有限公司；來曲唑片（批號191107 KG），購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；大鼠孕酮（P）、雌二醇（E2）、促黃體激素（LH）、睪酮（T）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）ELISA 試劑盒（批號GR2020?07），均購自武漢基因美生物科技有限公司；高遷移率族蛋白（HMGB1）抗體、晚期糖基化終產物受體（RAGE）抗體（批號GR3216146?2、GR3274230?2），均購自艾博抗（上海）貿易有限公司。

1.3 儀器 5810R 型臺式離心機，德國Eppendorf 公司；DG5033A 型多功能酶標儀，南京華東電子集團有限公司；Nikon Eclipse Ti?SR 型倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；165?8001 型垂直板電泳槽，海門其林貝爾儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 造模 50 只SD 大鼠按照隨機數字表法隨機分為空白組10只，造模組40只，造模組大鼠灌胃給予0.5 mg／kg 來曲唑建立PCOS 模型，空白組大鼠灌胃給予蒸餾水，連續21 d，并在光學顯微鏡下觀察大鼠一個動情周期的陰道涂片。

2.2 析因設計方案與分組處理 選取滋腎育胎丸（A）與二甲雙胍（B）2 個實驗因素，每個因素取2 個水平（1 不使用，2 使用），將2 個因素2 個水平進行組合，見表1。大鼠造模成功后，按照隨機數字表法分為模型組（A1B1）、二甲雙胍組（A1B2，150 mg／kg）、滋腎育胎丸組（A2B1，1.5 g／kg）、聯合用藥組（A2B2，150 mg／kg 二甲雙胍＋1.5 g／kg滋腎育胎丸），每組10只，灌胃給予相應劑量藥物，每天1次，連續28 d。

表1 2×2 析因設計

2.3 檢測指標

2.3.1 卵巢形態學觀察 給藥結束后，各組大鼠禁食12 h，次日腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后腹主動脈取血，迅速摘取雙側卵巢及子宮，取卵巢固定于4%甲醛溶液中，常規石蠟切片，HE 染色，顯微鏡下觀察組織形態變化。

2.3.2 ELISA 法檢測血清性激素P、E2、LH、T 及子宮勻漿液VEGF 水平 血樣常溫放置30 min，4 ℃、3 000 r／min離心5 min，取上層血清保存待測，按照試劑盒說明書檢測血清性激素P、E2、LH、T 水平，以及一側子宮勻漿液VEGF 水平。

2.3.3 Western blot 法檢測子宮組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達 子宮組織充分剪碎后加入裂解液，冰浴30 min，4 ℃、12 000 r／min 離心20 min，收集上清，BCA 法檢測蛋白濃度，取40 μg 蛋白上樣，電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST 洗脫，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗脫，二抗室溫孵育2 h，化學發光法顯色，將膠片進行掃描存檔，用Image J 軟件分析目標條帶的光密度值。

2.4 統計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，數據以（）表示，如果服從正態分布且同時滿足方差齊的條件，則組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗，而藥物之間的交互作用采用析因設計方差分析；如果不服從正態分布，或者服從正態分布但方差不齊，則組間比較采用非參數檢驗，進一步成對比較采用Kruskal?Wallis H檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 動情周期監測 空白組存在規律的動情周期；模型組使用來曲唑誘導21 d后，大鼠動情周期失去規律性變化，均處于動情間期，細胞總數較為稀少，以白細胞為主，偶見一些有核上皮細胞，見圖1。

圖1 大鼠陰道涂片（×20）

3.2 滋腎育胎丸及二甲雙胍對PCOS 大鼠卵巢形態學的影響 空白組大鼠卵巢可見不同發育時期的初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡，卵泡內顆粒細胞層較厚且致密；模型組大鼠卵巢閉鎖卵泡較空白組增多，囊狀擴張明顯增加，顆粒細胞層數減少（←處）；二甲雙胍組、滋腎育胎丸組和聯合用藥組大鼠卵巢囊性擴張卵泡的數目明顯減少，卵巢局部形態與空白組大致接近，見圖2。

3.3 滋腎育胎丸及二甲雙胍對PCOS 大鼠血清性激素及子宮勻漿液VEGF 水平的影響

3.3.1 單因素方差分析 與空白組比較，模型組血清P 水平降低（P＜0.05），血清LH、T 水平及子宮勻漿液VEGF水平升高（P＜0.05），E2水平無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組、滋腎育胎丸組和聯合用藥組P水平均升高（P＜0.05），血清LH、T 水平及子宮勻漿液VEGF 水平均降低（P＜0.05），滋腎育胎丸組和聯合用藥組E2水平升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清性激素及子宮勻漿液VEGF 水平比較（，n＝10）

表2 各組大鼠血清性激素及子宮勻漿液VEGF 水平比較（，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.3.2 主效應與交互作用分析 根據析因設計方差分析的主體間效應比較來判斷滋腎育胎丸與二甲雙胍對于血清性激素及子宮勻漿液VEGF 水平是否存在交互作用。兩藥均有升高血清P 水平、降低血清T 水平的作用，但沒有交互作用（P＞0.05）；滋腎育胎丸有升高血清E2水平的作用，而二甲雙胍作用不明顯，兩藥之間不存在交互作用（P＞0.05）；兩藥均有降低血清LH 水平、子宮勻漿液VEGF水平的作用，且兩藥之間存在交互作用（P＜0.05），見圖3。

圖3 各檢測指標輪廓圖

3.4 滋腎育胎丸及二甲雙胍對PCOS 大鼠子宮組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠子宮組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組、滋腎育胎丸組和聯合用藥組大鼠子宮組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達降低（P＜0.05），見表3、圖4。

圖4 各組大鼠子宮組織HMGB1、RAGE 蛋白條帶圖

表3 各組大鼠子宮組織HMGB1、RAGE 蛋白表達比較（，n＝10）

表3 各組大鼠子宮組織HMGB1、RAGE 蛋白表達比較（，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

4 討論

現代研究表明，PCOS 患者血清LH 水平的異常增高引起雄性激素卵巢T 反饋性增加，而E2水平相對不足，引起高雄激素血癥，抑制卵巢正常發育與排卵［8］。PCOS 患者下丘腦?垂體?卵巢功能軸的失調可致使E2和P 缺乏調控，ER、PR 表達異常導致VEGF 及其受體VEGFR2 的過度表達，促使Akt 磷酸化，從而導致子宮內膜形成過度增殖的狀態以及上皮?間質異常轉化，干擾胚胎正常著床導致PCOS 患者的流產或不孕［9?12］。來曲唑與脫氫表雄酮這2 種藥物誘導造模的大鼠血清性激素均有改變，但脫氫表雄酮造模由于持續給予雄激素而難以區分內源性和外源性因素［13］，為了避免實驗受到干擾，本研究采用來曲唑法［14］建立腎虛型PCOS 大鼠模型。目前認為PCOS 多起病于青春期，成年PCOS 是青春期PCOS 的延續［15］，因此本研究選擇6 周齡大鼠。實驗結果顯示，模型組大鼠處于動情間期且性激素紊亂，卵巢組織病理切片具有明顯多囊樣改變，表明該模型基本符合臨床腎虛型PCOS 不孕患者的病理改變。

中醫認為PCOS 發病主要與腎?天癸?沖任?胞宮軸功能紊亂有關，涉及腎、肝、脾三臟，其中腎虛為根本病機［16］，而通過辨證施治可改善內源性激素分泌，達到調經、促孕的效果［4］。滋腎育胎丸方中菟絲子安胎補腎，人參大補元氣；續斷、桑寄生、鹽巴戟天、杜仲可輔助菟絲子益腎氣、補腎陽；白術、黨參輔助人參健脾補氣；艾葉止血溫經，砂仁調中理氣；枸杞子、熟地黃、阿膠、制何首烏養血滋陰；鹿角霜補元陽、生精髓，全方共奏健脾益腎、固元益氣之功［17］。本研究結果表明，滋腎育胎丸可升高E2、P 水平，降低LH、T 水平，抑制VEGF 過表達，對于腎虛型PCOS 大鼠，與二甲雙胍聯合用藥比單一用藥療效更佳。滋腎育胎丸治療后大鼠血清E2水平升高可能是來源于補足的氣血精微，以促進優勢卵泡的發育。

滋腎育胎丸與二甲雙胍對降低LH 和VEGF 具有交互作用，可能與其作用的靶點相同有關。HMGB1 與VEGF 蛋白的過表達有密切關系，高表達HMGB1 可直接作用于血管內皮細胞或間接作用于巨噬細胞上的受體，上調NF?κB，促進VEGF 生成［18］。本研究推測滋腎育胎丸聯合二甲雙胍對VEGF 過表達的治療作用可能與抑制HMGB1 信號通路活性有關，實驗結果顯示，滋腎育胎丸與二甲雙胍均可通過降低子宮組織HMGB1 及其配體RAGE 的表達，達到抑制VEGF 過表達的目的，這可能是滋腎育胎丸聯合二甲雙胍治療腎虛型PCOS 的作用機制之一。