蘆薈苷通過降低熱休克蛋白70的表達增強順鉑誘導的胃癌細胞凋亡*

程振宇，陳雪雷，葛菲，3，程錦，吳曉明，戚之琳△

（1皖南醫學院基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，活性生物大分子安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241002；2皖南醫學院臨床醫學院，安徽 蕪湖 241002；3皖南醫學院藥學院，安徽 蕪湖 241002）

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，位居世界腫瘤相關死亡原因中的第二位，其發病率在男性人群中位于常見腫瘤的第四位，在女性人群中位于第七位［1-2］，不僅如此，大多數每年新診斷的胃癌病例主要發生在亞洲和南美國家［3］。盡管手術是目前治療胃癌的主要方法，但化療能夠增加患者的生存率，也是治療轉移性胃癌的首選方法。順鉑（cisplatin，DDP）是胃癌患者最常用的化療藥物之一，通常與5-氟尿嘧啶和紫杉醇等聯合用于臨床胃癌患者的治療，以順鉑為基礎的化療可以顯著提高胃癌患者的生存率［4-6］。然而，遺憾的是，有些胃癌患者卻對順鉑具有內源性抵抗，另有一些胃癌患者經過一段時間治療后產生了化療耐藥，導致其療效顯著降低［7-8］。因此，如何提高該類患者對順鉑的敏感性成為急需解決的問題。

天然活性提取物因其抗腫瘤、抗炎和神經保護等方面的生物學活性，引起了研究者的廣泛關注［9-12］。蘆薈苷（aloin，ALO）是一種從蘆薈植物中提取的苦味、黃褐色化合物，可作為“天然香料”用于食物中，已有的研究表明，蘆薈苷具有包括抗炎、抗腫瘤在內的多種生物學活性［13-14］。也有研究發現蘆薈苷可減輕多柔比星誘導的心肌毒性［15］。該研究給我們探究蘆薈苷聯合順鉑治療胃癌提供了實驗思路。蘆薈苷能否增強胃癌細胞對順鉑的敏感性尚未見報道。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族在腫瘤細胞中高表達，且能夠促進腫瘤細胞的增殖、抑制腫瘤細胞凋亡，參與腫瘤的放療和化療抵抗［16］。熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）作為HSPs家族中的重要成員，高表達于多種腫瘤細胞，其過度表達是腫瘤預后不良的重要指標［17］。此外，我們前期研究表明，HSP70能夠對抗順鉑誘導的胃癌細胞凋亡［18］。鑒于HSP70在化療抵抗中的作用，靶向HSP70的治療將是提高腫瘤患者對順鉑敏感性的策略之一。

鑒于上述研究基礎，在本研究中我們探究蘆薈苷能否通過調控HSP70的表達增強胃癌細胞對順鉑的敏感性，并初步探討蘆薈苷調控HSP70表達的分子機理。

材料和方法

1 主要藥品和抗體

順鉑注射液購自江蘇豪森藥業基團有限公司；蘆薈苷（純度：99.8%）購自Selleck Chemicals；抗HSP70、PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-7和pro-cacpase-3單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；泛素化抗體購自Santa Cruz；GAPDH抗體購自愛博泰克（武漢）生物科技有限公司；Annexin VFITC/PI凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物股份有限公司。

2 細胞培養及傳代

胃癌HGC-27細胞購自廣州賽庫生物技術有限公司，用含10%胎牛血清（Lonsera），1%青霉素-鏈霉素雙抗（碧云天生物技術有限公司）的RPMI-1640培養基，置于37℃、5% CO2條件下常規培養，2～3 d傳代1次。

3 主要方法

3.1 DAPI染色檢測細胞核形態改變取對數生長期的HGC-27細胞接種于12孔細胞培養板，實驗分組如下：空白對照（control）組、蘆薈苷（ALO）組（200 mg/L）、順鉑（DDP）組（5 mg/L）和聯合（DDP+ALO）組（200 mg/L蘆薈苷+5 mg/L順鉑）。各實驗組分別用相應藥物處理24 h后，棄除細胞培養液，用PBS洗滌細胞1次，4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，PBS洗滌后加入DAPI工作液，室溫避光染色5 min，熒光倒置顯微鏡（Olympus）觀察實驗結果，并拍照。

3.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率HGC-27細胞分組同上，分組處理24 h后，棄去細胞培養液，PBS洗滌1次后，胰酶消化，200×g離心收集細胞，PBS洗滌后用500μL Binding Buffer重懸細胞，之后分別加入Annexin V與PI各5μL避光染色，最后用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

3.3 RT-qPCR實驗檢測HSP70 mRNA的表達細胞分組同上，分別用藥物處理6 h，提取胞內總RNA，進行含量與純度測定。首先通過逆轉錄合成cDNA，然后進行qPCR檢測，實驗條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s；55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環。采用2-ΔΔCt法分析實驗結果。qPCR中所需的HSP70和GAPDH上下游引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

3.4 Western bolt和免疫沉淀（immunecoprecipitation，IP）分別檢測蛋白表達及泛素化細胞分組同上，藥物分組處理細胞24 h，棄除細胞培養上清，預冷PBS洗滌1次后，加入含蛋白酶抑制劑（PMSF）的細胞裂解液，冰上裂解細胞40 min，期間經常搖動細胞培養板，確保細胞被充分裂解。13 225×g、4℃離心10 min，吸取上清液，通過BCA法進行蛋白定量。加入loading buffer煮沸10 min，取等量蛋白進行SDSPAGE。電泳后的蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜3次，然后加入相應Ⅰ抗4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入相應Ⅱ抗室溫孵育2 h。最后加入化學發光液和底物，采用化學發光成像系統檢測實驗結果。ImageJ對蛋白表達水平進行半定量檢測。對于IP實驗，全蛋白裂解液中加入HSP70 I抗，置于靜音混合器上4℃孵育過夜，次日加入agarose beads繼續孵育2 h，預冷PBS洗滌beads，在離心收集的beads中加入loading buffer煮沸10 min后進行Western blot檢測。

4 統計學處理

實驗數據采用均數±標準差（mean±SD）表示，SPSS 17.0進行數據分析，組間比較采用Studentt檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

1 蘆薈苷增強順鉑誘導的胃癌細胞凋亡

HGC-27細胞分別用蘆薈苷（200 mg/L），順鉑（5 mg/L）單獨或聯合處理24 h，DAPI染色檢測HGC-27細胞核形態學改變，蘆薈苷和順鉑單獨處理組，細胞核染色增強，并呈現出核濃縮現象；而兩者聯合組，不僅核染色與核濃縮現象較單獨處理組增強，還出現了核碎裂現象（圖1）。

Figure 1.The effect of aloin on cisplatin-induced morphological changes of nucleus（scale bar=100μm）.Cells of the control group had a light blue，round nuclear morphology.However，ALO or DDP treated cells showed different nuclear sizes and clear nuclear condensation.In addition to nuclear condensation，the nuclear fragmentation phenomenon was also detected in the combination group.圖1 蘆薈苷對順鉑誘導胃癌細胞核形態改變的影響

流式細胞儀檢測胃癌細胞凋亡率，結果如圖2所示，順鉑組細胞凋亡率為16.7%，顯著高于對照組的6.95%（P＜0.01）。蘆薈苷處理的HGC-27細胞，凋亡率為10.2%，雖然與對照組相比無統計學差異，但其與順鉑聯合作用后，胃癌細胞的凋亡率增加至33.74%，顯著高于蘆薈苷和順鉑單獨作用組（P＜0.01）。

Figure 2.The effect of aloin on cisplatin-induced apoptotic rate.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs DDP group.圖2 蘆薈苷對順鉑誘導胃癌細胞凋亡率的影響

Western blot檢測凋亡相關蛋白PARP和caspase的表達，結果表明，與對照組相比，順鉑單獨刺激的胃 癌 細 胞，PARP切 割 增 加，cleaved caspase-3和cleaved caspase-7的表達增強，pro-caspase-3表達水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。蘆薈苷組PARP切割和leaved-caspase3略有增強，pro-caspase3表達亦有降低。但是，在蘆薈苷和順鉑聯合作用下，PARP，caspase-3和cleaved caspase-7的切割均顯著高于單獨處理組（P＜0.01），pro-caspase-3的表達水平與單獨處理組相比亦顯著下降（P＜0.01），見圖3。

2 蘆薈苷和順鉑對HSP70表達的影響

RT-qPCR和Western blot分別檢測HSP70 mRNA和蛋白的表達情況。Western blot結果顯示，與對照組相比，蘆薈苷能夠顯著降低胃癌細胞中HSP70蛋白的表達（P＜0.01），順鉑單獨作用并不影響HSP70蛋白的表達，然而，聯合作用組HSP70的表達水平卻顯著低于順鉑組（P＜0.01），見圖4A；RT-qPCR結果表明，蘆薈苷能明顯抑制HSP70 mRNA的表達（P＜0.01），順鉑則有效增強HSP70 mRNA的表達水平（P＜0.01），但是，在兩者的聯合作用下，HSP70 mRNA的水平卻顯著低于順鉑單獨刺激組（P＜0.01），見圖4B。

3 蘆薈苷和順鉑對HSP70泛素化的影響

IP實驗結果表明，與對照組相比，蘆薈苷對HGC-27細胞中HSP70的泛素化水平無顯著影響，而順鉑卻顯著增強了HSP70的泛素化（P＜0.01），兩者聯合作用組，HSP70的泛素化水平與順鉑單獨作用組相比并無顯著差異（圖5）。

討 論

蘆薈苷作為一種天然活性提取物，具有多種生物學功效。我們前期研究也已經證明，蘆薈苷能夠抑制胃癌細胞的增殖和遷移，促進胃癌細胞凋亡［19-20］，且其抗腫瘤效應呈現出濃度依賴性。然而，高濃度的蘆薈苷也會給正常組織細胞帶來一定的毒副作用。能否采用較低濃度的蘆薈苷與順鉑聯用，達到既能增強胃癌細胞對順鉑的敏感性，也能降低蘆薈苷的毒副反應呢？

根據我們的前期研究，蘆薈苷在濃度（100～400）mg/L范圍內均能顯著抑制胃癌HGC-27細胞的活力［20］。在該實驗中，我們選擇抑制效果較為顯著，毒性也相對較低的濃度（200 mg/L）進行研究。通過DAPI染色檢測細胞形態學改變，流式細胞檢測細胞凋亡率和Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達，上述實驗結果均證明蘆薈苷能夠增強順鉑誘導的胃癌細胞凋亡。天然活性產物聯合順鉑誘導癌細胞凋亡的研究亦有報道，如黃連素聯合順鉑能誘導卵巢癌細胞的凋亡［21］。也有研究發現，天然活性提取物可通過誘導胃癌細胞凋亡，抑制多柔比星耐藥［22］。結合上述研究，天然活性提取物聯合化療藥物用于腫瘤治療具有較好的應用前景。

Figure 3.The effects of aloin on cisplatin-induced apoptosis-related protein expression.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DDP group.圖3 蘆薈苷對順鉑誘導凋亡相關蛋白表達的影響

Figure 4.The effects of aloin and cisplatin on the expression levels of HSP70.A：the expression level of HSP70 protein；B：the mRNA expression level of HSP70.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs DDP group.圖4 蘆薈苷和順鉑對HSP70表達的影響

已有的研究表明，抑制HSP70的表達能夠顯著降低骨肉瘤細胞的化療抵抗作用［23］；抑制HSP70能夠顯著促進胃癌細胞對順鉑的敏感性［19］。也有研究證明，天然活性提取物馬錢子堿通過降低HSP70的表達，促進前列腺癌細胞凋亡［24］。為進一步探究蘆薈苷增強胃癌細胞對順鉑敏感性的可能分子機制，我們檢測了HSP70的表達。我們的實驗結果也顯示，蘆薈苷能夠降低胃癌細胞中HSP70的表達。雖然順鉑處理的胃癌細胞，HSP70蛋白表達基本不受影響，但是兩者聯合作用組，HSP70蛋白的表達顯著低于順鉑組。該現象說明，蘆薈苷可通過降低HSP70的表達，增強胃癌細胞對順鉑的敏感性。為探明蘆薈苷和順鉑引發該現象的原因，我們在轉錄水平和蛋白降解水平分別檢測了蘆薈苷和順鉑對HSP70的影響。結果顯示，蘆薈苷能夠下調HSP70 mRNA的表達，對HSP70的泛素化水平并無顯著影響。該現象提示，蘆薈苷在轉錄水平下調HSP70的表達。雖然順鉑能夠在轉錄水平誘導HSP70 mRNA的表達，亦能顯著增強HSP70的泛素化，但是，順鉑處理的胃癌細胞，HSP70的蛋白水平并無顯著變化。推測出現該現象的可能原因是：順鉑對HSP70轉錄和蛋白降解的影響旗鼓相當，最終呈現出對HSP70蛋白表達并無顯著影響的總效應。這也與我們之前的研究一致［19］。其他課題組的研究也證明，不同濃度的順鉑處理非小細胞肺癌NCI-H1299和Beas-2B細胞24 h后，HSP70的表達水平亦無顯著變化［25］。蘆薈苷與順鉑聯合組雖能有效降低順鉑誘導的HSP70 mRNA表達，但并不影響順鉑誘導的HSP70泛素化。該結果同樣支持蘆薈苷主要在轉錄水平下調HSP0表達的結論。

Figure 5.The effects of aloin and cisplatin on the expression levels of HSP70 ubiquitination.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖5 蘆薈苷和順鉑對HSP70泛素化的影響

雖然我們的研究提示，蘆薈苷能夠在轉錄水平有效抑制HSP70的表達，與順鉑聯用可促進其誘導的胃癌細胞凋亡。但是，尚有一些問題沒有闡明，例如蘆薈苷抑制HSP70 mRNA表達的具體信號途徑；順鉑上調HSP70 mRNA和泛素化的分子機制等。解決上述問題將是我們后續工作的重點。

總之，本研究初步證明蘆薈苷可通過下調HSP70的表達，增強胃癌細胞對順鉑的敏感性。該研究將為順鉑耐藥的胃癌患者提供可行的治療策略，并為蘆薈苷輔助治療腫瘤提供實驗支持。