正交試驗優選補血養元合劑提取工藝

陳艷熙，陳安利，馬 卓

(湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068)

月經問題對年輕女性生活、工作及健康有很大的影響[1]。經期常伴有多種癥狀，如輕度抽筋、力竭等，嚴重者甚至會導致不孕[2-4]。中藥因其多靶點、副作用少等優勢，深受女性患者的喜愛，而月經不調等癥狀多與氣血不足，陰虛等有關，故可選擇補腎益氣的藥方進行調理[5]。補血養元合劑由淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等組成。其中，淫羊藿、黃芪屬君藥，起補氣升陽功效；月季花等為臣藥，起活血調經功效；山茱萸等為佐藥，起補腎養陰功效；香附等為使，起疏肝行氣功效。使合劑具有補腎益氣、養血調經及治療陰陽平衡失調所致的月經不調、痛經和不孕癥的功效，適應于各種貧血、證屬氣血虧虛者[6]。

本實驗為考察不同提取因素對補血養元合劑質量的影響，設計正交試驗優選出合劑的最佳水提工藝，為合劑的進一步開發奠定基礎。

1 材料

1.1 試藥

淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等中藥材購自湖北強康中藥飲片公司，經鑒定符合《中國藥典》2020版一部該藥材項下標準。

淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定研究院，純度98.9%，供含量測定用)。乙腈、甲醇為色譜純，甲酸為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗儀器

R206B旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)，賽默飛U3000高效液相色譜儀(匠析生物科技有限公司)，H1650-W醫用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，ZFI-Ⅱ紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)，C21-SN216多功能電磁爐，實驗室超純水器(武漢優普純水設備有限公司)。

2 方法與結果

2.1 藥材吸水率試驗

為提高中藥飲片水提實驗加水量的準確度，確保飲片中有效成分的溶出度，提高補血養元合劑質量，對中藥飲片的吸水量進行考察。按處方比例準確稱取淫羊藿、山茱萸、月季花、香附等中藥飲片共3組，每組重315 g，分別用紗布包裹，加入10倍量水浸泡，常溫(25 ℃)放置，分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、12 h時取出藥材，濾除多余水分，以無液體流出為標準，稱量濕飲片的重量記錄數值，按如下公式計算吸水率[7-8]，測定結果見表1。

表1 中藥飲片吸水率 %

由表1可知，3 h之后藥材的吸水率增加且緩慢達到飽和，測得飽和吸水率平均值為118.74%，因此首次提取時需多加1倍水。

2.2 淫羊藿苷含量測定[9-11]

2.2.1色譜條件采用十八烷基硅烷鍵合硅膠分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈(A)-0.2%甲酸(B)。流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，檢測波長260 nm。梯度洗脫：0～20 min，20%A；20～30 min，20%～40%A；30～30.5 min，40%～20%A；30.5～33 min，20%A。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷對照品1.0 mg，加甲醇溶解，定容至100 mL容量瓶，搖勻，即得10 μg/mL對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取制備好的合劑1 mL，甲醇定容至100 mL，靜置一夜后，0.22 μm濾膜過濾。濾液即為供試品溶液。

2.2.4陰性對照溶液的制備按處方配比準確稱取除淫羊藿以外的其他中藥飲片，處理方法同“2.2.3”。

2.2.5專屬性試驗對上述對照品、供試品、陰性溶液進行色譜分析，結果見圖1。結果顯示陰性無干擾，說明方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜

2.2.6線性關系考察精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL對照品溶液，用甲醇定容稀釋成2、4、8、16、32 μg/mL，依次進行色譜分析。以濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y進行回歸(圖2)，得回歸方程：y=0.2798x-0.0617(R2=0.9999)，說明淫羊藿苷在2～32 μg/mL范圍線性關系良好。

圖2 淫羊藿苷標準曲線

2.2.6精密度實驗重復取6次對照品溶液，每次20 μL進行色譜分析。測得淫羊藿苷峰面積RSD為 0.294%，表明儀器精密度良好。

2.2.7重復性實驗按處方稱取飲片6份，平行制備6份供試品溶液進行色譜分析。測得淫羊藿苷峰面積RSD為 1.24%，說明該方法重復性良好。

2.2.8穩定性實驗分別在0、2、4、6、8、10、24 h取同一供試品溶液20 μL進行色譜分析。測得淫羊藿苷峰面積RSD為1.73%，說明淫羊藿苷在24 h內性質穩定。

2.2.9加樣回收率實驗取9份供試品溶液(每份含9.359 μg淫羊藿苷)，分為3組，各組分別加入淫羊藿苷標準品高中低劑量，用甲醇定容后進行色譜分析，結果見表2。

表2 加樣回收率實驗結果

實驗測得淫羊藿苷平均加樣回收率為99.97%，RSD為1.09%，說明該含量測定方法準確可靠。

2.3 干膏得率測定

取制備好的合劑300 mL，置于干燥至恒重的坩堝中，水浴蒸干，再于烘箱中105℃干燥3 h，移至干燥器中冷卻30 min，精密稱定其質量。

干膏得率=干膏質量/原藥材質量×100%

2.4 單因素考察實驗

2.4.1加水倍數按處方配比精密稱取中藥飲片，分別加4、6、8、10、12倍水，提取2次，每次1 h，合并2次煎煮液并濃縮，得到提取液。由圖3可知，隨水倍數增加，淫羊藿苷含量和干膏得率呈先增加后下降趨勢。究其原因，可能是當加水量過少，飲片未能浸泡完全，有效成分及其他物質溶出率低；當加水量過多，飲片中除淫羊藿苷外的其他物質也充分溶出，物質間可能發生了相互作用。當加入8倍水時，淫羊藿苷含量和干膏得率達到最大值，故選擇6倍、8倍、10倍水為后續優化參考水平。

圖3 加水倍數

2.4.2提取時間按處方配比精密稱取中藥飲片5份，分別提取30、60、90、120、150 min，均加入8倍水，提取2次，合并2次煎煮液并濃縮，得到提取液。由圖4可知，隨著提取時間延長，淫羊藿苷含量和干膏得率呈現先增加后下降趨勢，可能是提取時間太短使得飲片中溶出的成分過少，而長時間提取則會使溶出的成分被破壞。淫羊藿苷含量和干膏得率在提取1h時達到最大值，故選擇0.5、1、1.5為后續優化參考水平。

圖4 浸提時間

2.4.3提取次數按處方配比精密稱取中藥飲片3份，依次提取1、2、3次，均加8倍水，每次提取1 h，然后將煎液過濾并濃縮，得到提取液。由圖5可知，淫羊藿苷含量和干膏得率在提取2次后達到最大值，可能原因是提取次數過少，飲片成分不能充分溶出，而提取次數過多，則溶出的成份被破壞或成分之間發生相互作用使其含量降低。故選擇提取次數為1次、2次、3次為后續優化參考水平。

圖5 浸提次數

2.5 水提正交試驗方案設計

用L9(34)正交表設計試驗，正交試驗因素水平表見表3。測定淫羊藿苷含量(a)和干膏得率(b)進行綜合評分(Y)，其中淫羊藿苷含量占評分70%，干膏得率占評分30%。直觀結果見表4，方差分析見表5。

表3 因素水平表

表4 提取工藝正交實驗直觀分析表

表5 方差分析結果

從表4中極值R可以看出，影響淫羊藿苷含量的3個因素次序為：提取次數>加水倍數>提取時間。與方差分析表所分析的“因素A和因素C對實驗有顯著影響”結論相同。根據以上實驗結果，考慮到成本和提取時長，確定最佳提取工藝為A2B1C2，即8倍水提取2次，每次1 h。

2.6 驗證實驗

按處方配比稱取中藥飲片3份，按優化工藝A2B1C2(8倍水提取2次，每次1 h)做3次平行試驗，測定干膏得率和淫羊藿苷含量。試驗結果見表6，淫羊藿苷含量為27.55 μg/mL，干膏得率為36.26%。驗證結果與正交結果相近，說明優化的工藝條件具有可行性。

表6 驗證實驗結果

3 結束語

本研究采用正交法優選補血養元合劑的提取工藝。結果表明，與常規提取條件所得結果相比，優化工藝合劑中有效成分含量顯著提高，且最佳工藝條件為8倍水提取2次，每次1 h。驗證實驗表明，本法具有可行性，且優化工藝操作簡單、有可靠性，為制劑的大規模制備奠定了基礎。

本研究重在優化補血養元合劑的提取工藝，提高有效成分的溶出度，若要保證臨床安全用藥，確定臨床用藥劑量，則還需進行藥理學和毒理學實驗。