不同產地黑豆質量評價

李佳榮， 劉 美， 鄧 莎， 葛珈銘， 李夢園， 韓翠婷， 張 堅， 馬 琳，李先寬*

(1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.神木市醫院藥劑科，陜西 榆林 719300)

黑豆是豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr.的干燥成熟種子，全國各地均有生產[1]，《本草綱目》[2]記載“大豆有黑、白、黃、褐、青、斑數色，黑者名烏豆，可入藥及充食”。黑豆具有益精明目、養血祛風、利水、解毒之功效[3]，其煎煮取汁用于炮制何首烏、川烏、草烏、附子等多種藥材，可使藥物毒性降低，補益療效增強[4-5]。由于黑豆質量對黑豆汁制中藥飲片的質量、療效、用藥安全等具有重要意義[6]，故本實驗對不同產地該藥材質量進行評價。

1 材料

LC-20AT型液相色譜儀、Labsolution色譜數據工作站(日本島津公司)；SB25-12DTDN型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；H1650-w型高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；FA2104型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。

大豆苷、大豆苷元對照品(批號111738-201603、111502-200402，中國食品藥品檢定研究院)。黑豆共51批，經天津中醫藥大學馬琳教授鑒定為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的干燥成熟種子。甲醇、磷酸為色譜純；水為純蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量20 μL，色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

1.大豆苷 2.大豆苷元1.daidzin 2.daidzein

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取大豆苷、大豆苷元對照品適量，置于5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成質量濃度為513、21 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材粉末(過65目篩)l.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理30 min，取出，放至室溫，60%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，稀釋至不同質量濃度，在“2.1”項色譜條件下各進樣20 μL測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程分別為大豆苷Y=69.69X+0.075 6(r=0.999 7)，線性范圍0.75～300 μg/mL；大豆苷元Y=0.072 7X+0.01(r=0.999 9)，線性范圍0.062 5～25 μg/mL。

2.3.2 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得大豆苷、大豆苷元峰面積RSD分別為0.24%、0.63%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得大豆苷、大豆苷元峰面積RSD分別為1.96%、1.47%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得大豆苷、大豆苷元峰面積RSD分別為1.98%、2.08%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批各成分含量已知的樣品6份，每份0.5 g，加入大豆苷、大豆苷元對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，大豆苷、大豆苷元平均加樣回收率分別為100.38%、99.70%，RSD分別為2.50%、2.33%。

2.3.6 樣品含量測定 取51批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下各進樣測定3次，計算含量，結果見表2。

由此可知，大豆苷含量最高的前10批樣品依次為S12>S41>S11>S27>S24>S18>S20>S13>S19>S42；大豆苷、大豆苷元總含量最高的前10批樣品依次為S41>S12>S11>S27>S20>S24>S18>S19>S42>S13，而最低的4批樣品為S8、S15、S36、S49，并且浸出物含量均低于12.0%。

2.4 聚類分析 將表2數據導入SPSS 21.0軟件，采用組間聯接法，以平方Euclidean距離為測度進行系統聚類分析，結果見圖2。由此可知，各批樣品聚為6類，S11～S13、S18～S20、S24、S27、S41～S42為第Ⅰ類，大豆苷含量及大豆苷、大豆苷元總含量最高，產自陜西、山西、河北、江蘇、廣東；S2、S6、S9、S16、S39為第Ⅱ類；S3、S10、S17、S22、S37為第Ⅲ類；S1、S4～S5、S7～S8、S14～S15、S21、S26、S29～S32、S35～S36、S38、S43～S49為第Ⅳ類；S25、S34為第Ⅴ類；S23、S28、S33、S40、S50～S51為第Ⅵ類。

圖2 51批樣品聚類樹狀圖

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 圖譜生成 取“2.2.2”項下供試品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，指紋圖譜(圖3)以AIA格式導出，并導入“2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件。采用平均數法，設置S41作為參照圖譜，進行多點校正，Mark峰匹配，生成對照指紋圖譜R。結果，共標定了23個共有峰，其中峰12為大豆苷，峰22為大豆苷元。

2.5.2 相似度評價 指紋圖譜中非共有峰峰面積占比為10.79%～74.9%，共有峰峰面積RSD為24.26%～99.26%，表明51批樣品中成分相似，但各共有成分之間的差異較大；除S15、S36、S49外，其他批次樣品指紋圖譜相似度均在0.90以上。

表2 各成分含量測定結果

圖3 51批樣品HPLC指紋圖譜

3 討論

中藥炮制輔料的標準體系不夠健全，黑豆尚缺炮制用輔料標準[7]。黑豆集“藥輔同源”“藥食同源”[8]于一身。原料來源廣，各地炮制用輔料質量高低不一；成分復雜，缺乏統一指標成分標準，均為目前黑豆汁炮制藥材待解決的問題[9]。近年來，科研工作者研究了黑豆汁炮制品及其生品的有效成分、毒性成分和功效變化，但針對黑豆的質量標準化研究較少，本研究從輔料源頭探討，以期完善黑豆汁輔料標準。

清代《本草述鉤元》釋義[10]記載：“烏豆，緊小者為雄，入藥尤良”。現代研究與黑豆傳統用法一致表明小粒黑豆炮制何首烏效佳[11]。“藥黑豆，外黑內綠者真”，清代提及藥用黑豆子葉為綠色[1]。依據孟德爾性狀分離定律，子葉黃色相對綠色為顯性性狀[12]，優質黑豆的生態性狀是自然選擇的結果。大豆異黃酮是黑豆的生物活性成分，多以糖苷的形式存在，被腸道菌群分解為苷元型被人體吸收，從而發揮較高生物活性[13-15]。大豆苷和大豆苷元作為黑豆有效成分指標，大豆苷元含量越高，其炮制品藥效越好[16-17]。由于大豆苷元含量在黑豆中較低，炮制過程導致部分流失[18]，初步說明黑豆中大豆苷與大豆苷元總含量越高，相應黑豆汁炮制品質量越好[19]。黑豆汁炮制藥材的作用機理有待進一步探究。

通過高效液相色譜法測定51批樣品中的大豆苷和大豆苷元含量，建立HPLC指紋圖譜，并結合聚類分析方法較好地實現對不同來源黑豆的區分。優質黑豆皮緊粒小，黑皮黃仁，表面光滑，具光澤，一側有淡黃白色長橢圓形種臍，質堅硬，種皮薄而脆，子葉2，肥厚，淡黃色，氣微，味淡，嚼之有豆腥味，可作為黑豆質量的性狀鑒別標準。優質黑豆中大豆苷含量≥0.09%，大豆苷元含量≥0.003%，浸出物含量≥17%，出粉率≥89%，主要分布在廣東、陜西、河北、山西、江蘇等地[11]。

綜上所述，本研究建立的黑豆質量評價方法操作簡便，所建立HPLC指紋圖譜的色譜峰重疊率、相似度較好，可用于綜合評價該藥材的整體質量，并為篩選優質品提供參考依據，便于科學、合理地開發利用炮制輔料。