含淫羊藿、補骨脂中成藥的用藥特點分析

時瀟麗， 楊德超， 徐光臨， 張建偉， 劉 力

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021)

淫羊藿、補骨脂為常用補益類中藥，前者具有補腎陽、強筋骨、祛風濕功效，而后者具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉、外用消風祛斑功效，兩者均味辛性溫，兼能溫補腎陽，與其他補虛藥配伍使用常見于治療腎陽不足、肝腎虧損、肺腎氣虛或脾腎陽虛的處方中。近年來, 相繼有壯骨關節丸、仙靈骨葆膠囊等中成藥引起藥源性肝損傷的報道[1-2]，國家藥品監督管理局也發布了相應通報[3-4]，可能與方中淫羊藿、補骨脂肝毒性相關[1-2,5]，在免疫應激狀態下兩者均可誘導本病，而且配伍較單用情況更嚴重[6]。因此，本研究對含淫羊藿、補骨脂中成藥進行數據挖掘，并采用網絡毒理學研究兩者配伍的潛在肝毒性成分及機制，以期為科學合理地使用相關中成藥提供依據。

1 資料與方法

1.1 處方收集與分析 收集2020年版《中國藥典》和《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》中含有淫羊藿或補骨脂的中成藥處方，其中前者含淫羊藿的中成藥56種，含補骨脂的中成藥43種，同時含兩者的中成藥11種；后者含淫羊藿的中成藥180種，含補骨脂的中成藥129種，同時含兩者的中成藥47種。排除上述2部標準均收錄的6種(老年喘咳片、再造生血片、腎寶合劑、腎寶糖漿、蠶蛾公補片、益腎靈顆粒)，最終納入同時含淫羊藿、補骨脂的中成藥共52種。將上述中成藥錄入Excel 2019軟件，參照2020年版《中國藥典》和《中藥學》對中藥藥名、藥物功效分類、歸經進行規范后，對藥物、功效分類、歸經、劑型、主治疾病頻次，以及淫羊藿、補骨脂日服用量進行分析。

1.2 網絡毒理學研究

1.2.1 潛在肝毒性靶點篩選 通過PubMed、知網、萬方數據庫檢索淫羊藿、補骨脂中與肝毒性相關的活性成分,利用SwissTarget Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測其相關靶點(probability≥0.05)。在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)中以“liver toxicity”為關鍵詞，查找肝毒性相關靶點(score≥6.00)。采用Venny2.1在線工具將UniProt 數據庫(https://www.uniprot.org)規范化后的淫羊藿、補骨脂活性成分靶點與肝毒性主要靶點進行交集分析，獲得兩者潛在肝毒性靶點。

1.2.2 肝毒性靶點蛋白與蛋白互作(PPI)網絡構建 將潛在肝毒性靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org)中，構建靶蛋白相互作用網絡(protein-protein interaction network，PPI network)，生物種類設定為“Homosapiens”，其余參數保持默認，結果保存為TSV格式并導入Cytoscape 3.6.0軟件，對各靶點度值進行排序，預測淫羊藿配伍補骨脂產生肝毒性的核心靶點。

1.2.3 藥物-活性成分-肝毒性靶點網絡構建 將淫羊藿、補骨脂所含與肝毒性相關的活性成分和預測的潛在肝毒性靶點進行關聯，采用Cytoscape 3.6.0軟件構建藥物-成分-肝毒性靶點網絡關系圖，通過“Network Analyzer”功能進行關鍵靶點的分析。

1.2.4 潛在肝毒性靶點功能與通路的富集分析 利用Omicshare平臺候選基因作為背景，對淫羊藿、補骨脂潛在肝毒性靶點進行GO功能、KEGG信號通路富集分析，生物種類設定為“Homosapiens”，其中GO功能分析包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組成(celluar component，CC)。將GO功能、KEGG信號通路富集閾值設定為P<0.001，并對兩者進行可視化分析。

2 結果

2.1 中藥頻次、功效、歸經 在2020年版《中國藥典》中，木香分為木香、川木香，牛膝分為牛膝(懷牛膝)、川牛膝，附子分為附片、黑順片，同一品種不同炮制方法按同一藥材計，如“醋制五味子”“酒制五味子”“蒸五味子”均計為“五味子”，共得到227味中藥，累積頻數1 262次，排名前20的見表1，其中補骨脂包括生補骨脂21次、炒補骨脂5次、鹽補骨脂26次，淫羊藿包括生淫羊藿31次、炙淫羊藿21次。處方中頻次最多的中藥是補虛藥，其次是活血化瘀藥、溫里藥、收澀藥，見表2。處方中的中藥主要歸腎經、肝經，見表3。

表1 頻次前20的中藥

表2 中藥功效分布

表3 中藥歸經分布

2.2 劑型與主治疾病 52種中成藥中有9種劑型，以丸劑最多，見表4，其中至寶三鞭丸為濃縮丸或大蜜丸，壯骨關節丸為濃縮丸或水丸，共計蜜丸8種、水丸4種、水蜜丸3種、濃縮丸3種，可發揮藥效持久、緩和毒性的特點，以治療腎陽不足、氣血虛弱等證型為主。另外，主治疾病包括腎系疾病、肺系疾病、肝腎疾病、脾腎疾病、關節炎等，見表5，其中有47種涉及補腎功效。

表4 中成藥劑型分布

表5 中成藥主治疾病分布

2.3 淫羊藿、補骨脂日服用量分析 29種中成藥因處方未公布藥味劑量或未詳細闡述制備方法，未能計算出中成藥中淫羊藿、補骨脂的日服用劑量，其余見表6(按2020年版《中國藥典》用法用量中的最大服用量計算)，可知絕大多數均在6～10 g范圍內，僅生白合劑(生白口服液)中淫羊藿、補骨脂，以及肺氣腫片中補骨脂存在超量風險。

表6 淫羊藿、補骨脂日服用量

2.4 網絡毒理學研究

2.4.1 潛在肝毒性靶點篩選 根據文獻[7-17]報道，篩選出淫羊藿中與肝毒性相關的活性成分有淫羊藿素、寶藿苷Ⅰ等8種，通過SwissTarget Prediction數據庫預測的靶點有122個；補骨脂中相關成分有補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚等7種，預測的靶點有264個，見表7，其中兩者共有靶點有60個。再通過GeneCards數據庫，獲得與肝毒性相關的靶點共1 122個，將活性成分靶點與其取交集，共得到109個交集靶點，即為潛在肝毒性靶點。

表7 淫羊藿、補骨脂中與肝毒性相關的活性成分

2.4.2 潛在肝毒性靶點蛋白與蛋白互作(PPI)網絡構建 采用String數據庫、Cytoscape 3.6.0構建“2.4.1”項下潛在肝毒性靶點的PPI網絡圖，見圖1，可知108個靶點之間可發生蛋白相互作用(1個靶點未參與)，其中度值≥30的靶點共16個，分別為AKT1、CASP3、EGFR、MAPK3、HSP90AA1、ESR1、MAPK1、TNF、ERBB2、PTGS2、BCL2L1、EP300、PIK3CA、PPARG、APP、MCL1，可能是核心靶點。

注：連線代表蛋白與蛋白之間的相互作用。節點越大，顏色越深，表示度值越大。

2.4.3 藥物-活性成分-肝毒性靶點網絡構建 構建淫羊藿、補骨脂，與肝毒性相關的活性成分，“2.4.1”項下潛在肝毒性靶點的網絡，見圖2。在與肝毒性相關的活性成分中，度值排名靠前的為淫羊藿中淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ，以及補骨脂中補骨脂二氫黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂乙素、補骨脂酚，推測淫羊藿與補骨脂配伍后可能通過EGFR、HSP90AA1、TNF、ERBB2、PTGS2、EP300、PPARG等核心靶點加重肝損傷，見表8。

2.4.4 富集分析 排名前20的GO、KEGG富集分析結果見圖3，可知生物過程相關的條目有359條，主要涉及刺激反應、絲氨酸肽磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、細胞程序性死亡(programmed cell death)等；分子功能相關的條目有53條，主要涉及催化活性(catalytic activity)、相同蛋白結合(identical protein binding)、小分子結合(small molecule binding)等；細胞組成相關的條目有32條，主要涉及細胞質部分(cytoplasmic part)、胞內細胞器內腔(intracellular organelle lumen)等，而KEGG 通路富集有116個，主要涉及癌癥途徑(pathways in cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway)、癌癥中的中央碳代謝(central carbon metabolismin cancer)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等。

注：藍色節點代表淫羊藿、補骨脂，綠色節點代表與肝毒性相關的活性成分，紅色、黃色節點代表肝毒性靶點(其中黃色節點為兩藥共有肝毒性靶點)，每條邊代表節點之間的相互作用關系。

3 討論

在2020年版《中國藥典》中，同時含淫羊藿、補骨脂的中成藥數量占相關中成藥總數的12.5%，而在《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》中其占比為17.9%。在52種中成藥中，除了正骨膏為清代宮廷御醫所創驗方外，其余均為院內制劑或民間驗方研發制得。在國家藥品不良反應監測中心分別于2001、2008年對壯骨關節丸引起肝損傷等不良反應情況進行通報[2]后，國內研究者針對壯骨關節丸的毒性藥材、肝毒性機制和合理用藥等進行了探索，從動物或細胞實驗已證實補骨脂、淫羊藿單味藥材或其中所含活性成分具有一定的肝損傷作用[7-17]。因此，存在超劑量風險的如生白合劑、肺氣腫片以及長時間用藥的中成藥如補腎防喘片(在用法用量中注明3個月為1個療程)等安全性需重點關注。

生白合劑(口服液)主要用于癌癥放化療引起的白細胞減少屬脾腎陽虛等，制劑中淫羊藿、補骨脂的日服用劑量均大于2020年版《中國藥典》用法用量，在對2 140例患者服用生白口服液的安全性研究中，共報道5例有谷丙轉氨酶輕度升高，未見明顯肝腎功損害或其他不良反應[18]，表明該制劑短周期服用(7～14 d)相對安全。但壯骨關節丸中淫羊藿、補骨脂日服用劑量遠低于藥典規定，且制劑中乳香、沒藥等易致肝損傷中藥的日服用量也相對較低，在肝毒性病例報道中部分患者口服該制劑經常連續數月，推測發生肝臟不良反應的原因可能是長期連續服用導致藥物蓄積，提示上述中藥的日服用劑量雖然沒有超劑量，但也應警惕長期用藥安全性[2]。

合理配伍是降低中藥毒性的有效措施，從而提高臨床用藥的安全性。黃迎等[1]基于免疫應激介導的特異質肝損傷模型，發現仙靈骨葆方中續斷、知母、地黃、丹參有減輕淫羊藿、補骨脂引起的肝損傷作用，以丹參效果最好。凌潔等[19]提出斑馬魚毒性/代謝同步進程法，揭示了淫羊藿中毒及其配伍巴戟天后的減毒作用。劉巧等[20]報道，補骨脂配伍生地、制首烏等可降低補骨脂產生的肝損傷。寧青等[21]發現，杜仲中桃葉珊瑚苷可顯著降低補骨脂對斑馬魚的肝臟毒性影響。在52種中成藥中，續斷出現11次，知母出現5次，地黃出現48次(含生地黃13次)，丹參出現5次，巴戟天出現17次，杜仲出現19次，但目前有關淫羊藿或補骨脂的配伍減毒及其機制的報道仍較少，因此，如何能在保證兩者發揮最佳療效的同時，通過藥味配伍使其毒性降到最低尚有待進一步研究。

在藥物-活性成分-肝毒性靶點網絡的構建中發現，淫羊藿、補骨脂肝毒性關鍵成分通過核心靶點產生作用，與肝細胞內部分蛋白氧化磷酸化、相互結合等生物學過程及AGE-RAGE、HIF-1信號通路等相關，兩者配伍后，可能通過EGFR、HSP90AA1、TNF、ERBB2、PTGS2、EP300、PPARG等核心靶點加重肝損傷。Gao等[22]參考壯骨關節丸中淫羊藿、補骨脂的劑量，通過非肝毒性劑量的脂多糖大鼠模型對淫羊藿、補骨脂、兩者配伍致肝損傷問題進行研究，發現在免疫應激下，“淫羊藿與補骨脂”為一對新的中藥配伍禁忌組合，NLRP3(NLR family, pyrin domaincontaining 3)炎癥小體活化相關病證是其致肝損傷的主要易感人群特征[22-23]。由此可知，中藥配伍禁忌是有條件和相對的，淫羊藿、補骨脂配伍合理性有待繼續確證。

眾所周知，“是藥三分毒”，故應客觀科學認識淫羊藿、補骨脂的肝損傷問題。目前，有關補骨脂、淫羊藿單味藥材或其活性成分肝毒性的研究基本上為動物、細胞實驗等，但所得結果往往與臨床實際有一定差距。因此，醫藥工作者在臨床上應關注含淫羊藿、補骨脂中成藥的安全性，尤其是對長期用藥患者，應監測其肝功能。