二甲雙胍對單側輸尿管梗阻小鼠腎臟纖維化的影響及其作用機制

張愛，張君杰，高琳琳，袁亦彤，周華，王艷秋

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院第一腎臟內科，沈陽 110004；2.遼寧電力中心醫院醫療服務保障部，沈陽 110002；3.沈陽醫學院附屬中心醫院病理科，沈陽 110024）

腎纖維化是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的共同特征，其機制復雜，包括細胞外基質蛋白（纖連蛋白和Ⅰ型膠原）產生及降解不平衡［1］、腎小管上皮細胞凋亡和萎縮、小管上皮-間質轉化、免疫細胞浸潤和分泌炎癥介質［轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等］多個環節［2］。目前腎纖維化尚無有效治療方法，因此，探索新的有效干預靶點預防和治療腎纖維化尤為重要。

已有研究顯示，二甲雙胍在癌癥和心血管疾病［3］、非酒精性脂肪性肝炎［4］的治療中也發揮重要作用。在小鼠模型中二甲雙胍可以通過抑制TGF-β信號通路緩解葉酸誘導的腎間質纖維化［5］。在單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠模型中，二甲雙胍也能通過抑制TGF-β信號通路減輕腎臟的纖維化［6］。

Hippo/YAP通路不但調節細胞分裂、增殖、分化和凋亡，還在機體的生長發育及調控器官大小等方面發揮重要作用。正常機體內，處于活化狀態的Mst1/2能夠磷酸化并激活其底物LATs1/2，進一步磷酸化其下游YAP，導致其無法入核，喪失轉錄輔助因子的功能。生理狀態下的Hippo/YAP通路能夠負調控其下游效應分子YAP的轉錄活性，以限制組織過度生長，從而在維持細胞增殖和凋亡穩態方面發揮作用。而在病理狀態下，YAP發生去磷酸化并進入細胞核與其下游靶蛋白TEAD結合，促進Hippo/YAP通路下游靶基因的轉錄［7］。近年來Hippo/YAP通路的研究多集中于抗腫瘤領域［8］。近期研究［9］發現Hippo/YAP信號通路可能參與心血管疾病的血管重塑，與心血管疾病和腎臟疾病發生發展有密切關系。也有研究［10］提示Hippo/YAP信號通路可能參與缺血性急性腎損傷并促進腎纖維化。本研究探討二甲雙胍對UUO誘導的小鼠腎臟纖維化的影響及其作用機制，旨在為腎臟疾病的治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

30只5～7月齡C57BL/6小鼠，體質量20～25 g，SPF級，購自遼寧長生生物技術股份有限公司。本研究已獲得醫院倫理委員會批準（2020PS664K）。主要試劑包括二甲雙胍（美國Sigma公司），p-YAP（AP0489）、LATs1（A17992）、TEAD（武漢愛博泰克公司，A5218），YAP1（武漢賽維爾公司，GB11542），β-actin（武漢亞科因公司，A01011），F4/80（Sc-52664）、TGF-β1（美國Santa Cruz公司，Sc-1700），CD68（上海碧云天公司，AF6432）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組：小鼠隨機均分為假手術組、UUO組、二甲雙胍組，每組10只。采用單側輸尿管結扎術法［11］建立UUO小鼠模型，UUO組、二甲雙胍組小鼠5%異戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部消毒、備皮，取左側腹部腎區切口進入腹腔，游離左側輸尿管，在其上1/3處及腎門處以4-0手術線結扎。假手術組小鼠僅分離左側輸尿管但不結扎。二甲雙胍組手術前1 d開始采用二甲雙胍灌胃［200 mg/（kg·d），溶劑為生理鹽水］，連續7 d。UUO組和假手術組同時間給予等量生理鹽水灌胃。然后處死小鼠，膀胱穿刺收集尿樣，心臟穿刺留取血標本。生理鹽水灌注腎臟后，留取腎上極并進行石蠟固定，剩余腎組織及血、尿標本于-80 ℃冰箱儲存。

1.2.2 血尿標本檢測：按試劑說明書應用比色法檢測尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosidase，NAG），肌氨酸氧化酶法檢測血肌酐，脲酶法檢測尿素氮。

1.2.3 HE染色：腎臟組織石蠟切片（厚度4 μm）后HE染色，脫水封片，應用正置顯微鏡觀察腎臟組織纖維化程度的變化。

1.2.4 Masson染色：腎臟組織石蠟切片（厚度4 μm），烤片，脫蠟水化，Masson染色封片。顯微鏡（200倍）觀察并拍照。腎間質纖維化程度評分［12］：每張切片觀察20～30個視野并拍照，采用IPP軟件計算，纖維化程度評分=纖維化面積/總面積×100%。

1.2.5 免疫組化染色：腎臟石蠟切片（厚度4 μm），烤片、脫蠟，抗原修復，加一抗4 ℃過夜。二抗37 ℃反應45 min。DAB顯色劑，脫水，封片。200倍鏡下隨機選取5張圖像，使用 ImageJ 軟件測量并計算平均光密度。

1.2.6 免疫熒光染色：石蠟切片烤片、脫蠟，抗原修復，BSA封閉，一抗4 ℃過夜。二抗室溫避光染色1 h。DAPI染核，封片，固定。200倍鏡下隨機選取5張圖像，使用 ImageJ 軟件測量并計算平均光密度。

1.2.7 Western blotting檢測：提取腎臟組織蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。SDS-PAGE膠制備、上樣、跑膠、轉膜、封閉，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃ 60 min，ECL顯色。應用ImageJ采集圖像，以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值比值來進行半定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 3組小鼠尿NAG、血尿素氮和血肌酐水平比較

結果顯示，與假手術組比較，UUO組尿NAG顯著升高（P＜ 0.05），提示UUO模型建模成功。與UUO組比較，二甲雙胍組尿NAG顯著降低（P＜ 0.05）。血尿素氮和血肌酐3組比較無統計學差異（均P＞ 0.05），見表1。

表1 3組小鼠尿NAG、血尿素氮和血肌酐水平比較Tab.1 Comparison of urinary NAG，blood urea nitrogen，and serum creatinine levels among the three groups

2.2 3組小鼠腎臟組織HE和Masson染色比較

HE染色結果顯示，假手術組腎小球、腎小管結構基本正常，無明顯炎癥細胞浸潤。UUO組腎小管明顯擴張，呈不規則狀，甚至融合成空洞，腎小管刷狀緣完整性被破壞；集合管、遠曲小管擴張呈囊狀甚至消失；腎間質有較多炎癥細胞浸潤，纖維組織增生。與UUO組比較，二甲雙胍組腎間質病變改善，炎癥細胞浸潤減少，見圖1。

Masson染色結果顯示，假手術組藍色膠原沉積少，小管間質范圍窄。UUO組大量膠原纖維沉積，間質范圍增寬。而二甲雙胍組較UUO組膠原沉積減少。見圖1、表2。

圖1 3組小鼠腎臟病理HE和Masson染色結果×200Fig.1 HE staining and Masson staining of renal tissue in the three group ×200

2.3 3組免疫組化檢測及免疫熒光染色結果比較

免疫組化結果顯示，與假手術組比較，UUO組TGF-β1、CD68和YAP1表達顯著增加（均P＜ 0.05）；與UUO組比較，二甲雙胍組TGF-β1、CD68和YAP1表達均明顯下降（均P＜ 0.05）。見圖2、表2。

圖2 3組TGF-β1、CD68和YAP1表達比較×200Fig.2 Comparison of TGF-β1，CD68，and YAP1 expression in renal tissues among the three groups using immunohistochemical staining ×200

免疫熒光染色結果顯示，與假手術組比較，UUO組F4/80表達明顯增加（P＜ 0.05）；與UUO組比較，二甲雙胍組F4/80表達顯著降低（P＜ 0.05）。見表2、圖3。

圖3 3組免疫熒光染色結果×200Fig.3 Immunofluorescence staining of renal tissue among the three group ×200

表2 3組小鼠腎臟組織纖維化及TGF-β1、CD68、YAP1、F4/80表達比較（%）Tab.2 Comparison of renal fibrosis and the expression of TGF-β1，CD68，YAP1，and F4/80 among the three groups（%）

2.4 3 組Western blotting 檢測結果比較

結果顯示，與假手術組比較，UUO組腎臟組織中YAP1及下游靶蛋白TEAD的表達水平顯著增加（均P＜ 0.05），p-YAP和YAP1上游負調控分子LATs1的表達水平顯著減少（均P＜ 0.05）。與UUO組比較，二甲雙胍組YAP1及TEAD表達水平下降，p-YAP、LATs1表達水平增加（均P＜ 0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠腎臟組織中YAP1、p-YAP、LATs1、TEAD蛋白表達Fig.4 Protein expression of YAP1，p-YAP，LATs1，and TEAD in renal tissues among the three groups

3 討論

研究［13］顯示，正常腎臟組織結構損傷、纖維化的發生和發展是導致CKD的主要原因。在纖維化過程中肌成纖維細胞和炎癥細胞被認為是關鍵因素，而TGF-β尤為重要［14］。腎臟含有多種固有免疫細胞（樹突狀細胞、巨噬細胞和NK淋巴細胞等），在維持組織穩態方面起著重要作用，一旦被激活，就會產生炎癥介質，引發腎臟疾病［15］。有證據［16］表明腎組織中巨噬細胞浸潤參與腎移植轉歸、腎間質纖維化和腎小管萎縮；而且其浸潤水平和腎小球硬化、間質纖維化程度密切相關［17］。

關于UUO小鼠模型和進行性CKD患者的研究［18］顯示，骨髓來源的單核細胞/巨噬細胞能夠轉變為肌成纖維細胞，并通過巨噬細胞標志物（F4/80、CD68）和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的共表達以及膠原蛋白的產生來鑒定。巨噬細胞的聚集和分化在腎損傷的各個階段都至關重要［19］。巨噬細胞的過度積累是誘導腎損傷發生的重要因素，去除巨噬細胞可減少腎臟組織中的巨噬細胞募集及巨噬細胞來源的炎性細胞因子，降低腎臟的炎癥、氧化應激反應以及腎纖維化過程，從而減少腎臟組織損傷［20］。

UUO模型是較成熟的研究腎小管間質纖維化的模型。本研究結果顯示，與假手術組比較，UUO組尿NAG水平具有統計學差異（P＜ 0.05）；而血肌酐、血尿素氮3組比較無統計學差異（均P＞ 0.05），考慮可能與小鼠造模時間短、腎小管間質損傷時間短以及機體代償有關。本研究結果顯示，與UUO組比較，二甲雙胍組TGF-β1、CD68、F4/80的表達顯著減少（均P＜ 0.05），推測二甲雙胍可能通過抑制單核/巨噬細胞浸潤來降低腎臟炎癥反應，從而進一步抑制腎間質纖維化。

Hippo/YAP信號通路作為一種進化保守的通路，在從果蠅到人類的細胞增殖、凋亡和分化過程中發揮了重要作用。本研究結果顯示，UUO模型能夠顯著上調腎組織中YAP、TEAD的表達，并顯著下調其上游調控因子LATs和p-YAP的表達，而二甲雙胍治療能夠逆轉上述變化，提示腎組織中YAP信號通路的激活可能參與腎纖維化。

本研究結果顯示，二甲雙胍治療能顯著降低UUO小鼠的腎間質纖維化，而腎間質纖維化是CKD的共同特征，是進展為終末期腎病的病理基礎。因此推測二甲雙胍可能通過降低腎間質纖維化參與改善CKD的病理過程。Hippo/YAP信號通路在UUO模型腎組織中能顯著激活，并能通過上調促纖維化因子TGF-β1的表達水平促進腎纖維化過程，通過上調巨噬細胞抗原CD68、F4/80，激活巨噬細胞系統和炎癥反應，促進腎纖維化，進而導致腎臟結構和功能異常。

綜上所述，二甲雙胍可能通過干預Hippo/YAP信號通路來改善UUO模型小鼠的腎臟結構和功能異常。但本研究未獲得二甲雙胍通過抑制單核/巨噬細胞浸潤來降低腎臟炎癥反應的直接證據，因此結論有待進一步研究論證。