復(fù)方西羚解毒膠囊中5種成分在大鼠血漿中體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

羅 毅， 劉子夜， 姚元成， 耿紹軒， 曹桂云*， 孟兆青,*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000；2.山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 濟(jì)南 250000；3.山東省中醫(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250000)

復(fù)方西羚解毒膠囊是在《溫病條辨》經(jīng)典方劑銀翹散的基礎(chǔ)上，增加了羚羊角、水牛角粉、冰片衍化而來(lái)，用于治療外感風(fēng)熱、發(fā)熱、頭痛、咳嗽音啞、咽喉腫痛，被《山東省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥診療方案》《山東省中醫(yī)疫病防治方案(2022冬春季補(bǔ)充版)》推薦為新型冠狀病毒及其奧密克戎變異株的防治用藥。前期課題組采用LC-MS法從復(fù)方西羚解毒膠囊中分離得到145種成分，主要為黃酮、酚酸、三萜類型[1]，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定[2]。

中藥口服后吸收進(jìn)入血液，并能達(dá)到一定血藥濃度的成分才能發(fā)揮藥理作用[3-5]，而復(fù)方西羚解毒膠囊組成非常復(fù)雜，哪些成分能吸收入血，其藥動(dòng)學(xué)情況如何尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方西羚解毒膠囊中甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元在大鼠血漿中的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，以期為該制劑藥理活性及臨床作用研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent超高效液相系統(tǒng)(配置Agilent 1290 infinityⅡ二元泵、Agilent 1290 infinityⅡ自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent 1290 infinityⅡ柱溫箱)、Agilent G6530 Q TOF質(zhì)譜儀(配置電噴霧離子源)(美國(guó)Agilent公司)；BSA224S-CW電子天平[萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；XS105電子天平[十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；PS-60AL超聲波清洗器(山東東岳國(guó)際經(jīng)貿(mào)合作股份有限公司)；GTR22-1型高速低溫離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)。

1.2 試劑與藥物 復(fù)方西羚解毒膠囊(批號(hào)1802005)由山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)。芒柄花素(批號(hào)200328-161026，純度100%)、葛根素(內(nèi)標(biāo)，批號(hào)110752-201816，純度95.4%)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘草苷(批號(hào)102561，純度98.5%)、牛蒡子苷元(批號(hào)100686，純度98%)、甘草酸(批號(hào)102574，純度98.5%)對(duì)照品購(gòu)自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；異甘草苷(批號(hào)Y-008-181216，純度98%)對(duì)照品購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。色譜純乙腈購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；分析純甲酸購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；屈臣氏純凈水購(gòu)自屈臣氏集團(tuán)(香港)有限公司。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(魯)20190003，于光暗周期12 h的環(huán)境下飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，給予清潔級(jí)普通大鼠飼料飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取芒柄花素、甘草苷、異甘草苷、甘草酸、牛蒡子苷元、葛根素對(duì)照品適量，甲醇溶解制成貯備液，分別精密量取適量，甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，具體見(jiàn)表1。另外，精密稱取葛根素對(duì)照品適量，甲醇溶解定容并稀釋至3 μg/mL，即得內(nèi)標(biāo)溶液。

表1 對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度

2.2 給藥與采樣 取膠囊內(nèi)容物粉末100 g，10倍量純化水超聲提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并續(xù)濾液，旋蒸濃縮，在-20 ℃下放置12 h后冷凍干燥48 h，得干浸膏50 g，取適量，用去離子水分散均勻，作為藥液。取大鼠30只，眼眶后靜脈叢取血，置于肝素化EP管中，8 000 r/min離心10 min，即得空白血漿。

另取大鼠84只，隨機(jī)分為14組，每組6只，灌胃給予藥液(4.0 g/kg)，于10 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h、12 h、24 h眼眶后靜脈叢取血各1.5 mL，置于肝素化EP管中，8 000 r/min離心10 min，即得含藥血漿，在-20 ℃下保存。

2.3 樣品處理 取大鼠血漿800 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL、甲醇-乙腈(2∶1)混合溶劑4 mL，混勻，渦旋30 s，超聲處理2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液置于10 mL EP管中，在45 ℃下用N2吹干，分2次加入上述混合溶劑，每次400 μL，超聲處理2 min溶解殘?jiān)喜?次溶液，置于1.5 mL EP管中，45 ℃ N2吹干，加入100 μL甲醇，超聲處理2 min溶解殘?jiān)?2 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)樣5 μL分析。

2.4 UPLC-MS條件

2.4.1 色譜 流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫(0～13 min，21%乙腈；13～14 min，21%～42%乙腈；14～32 min，42%乙腈)；體積流量0.4 mL/min。

2.4.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式；掃描范圍m/z50～1 700；毛細(xì)管電壓3 500 V；出口電壓175 V；干燥氣(N2)體積流量8 L/min；干燥器溫度300 ℃；霧化器壓力35 psi(1 psi=6.895 kPa)，采用Masshunter Qualitative Analysis B.08.00處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。通過(guò)提取離子色譜圖進(jìn)行積分，各成分提取離子([M-H]-)分別為m/z267.065 7(芒柄花素)、m/z255.065 7(甘草苷)、m/z255.065 7(異甘草苷)、m/z821.396 0(甘草酸)、m/z371.149 5(牛蒡子苷元)，內(nèi)標(biāo)提取離子([M-H]-)m/z415.103 5。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 質(zhì)控樣品制備 取對(duì)照品溶液適量，45 ℃ N2吹干，加入空白血漿800 μL、內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，即得。

2.5.2 專屬性考察 取空白血漿適量，除不加內(nèi)標(biāo)外按“2.3”項(xiàng)下方法處理；取對(duì)照品溶液適量，45 ℃ N2吹干溶劑，加入空白血漿800 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理；取給藥后4 h血漿適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)各成分無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.5.3 線性關(guān)系考察 取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，45 ℃ N2吹干溶劑，加入空白血漿800 μL、內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，各成分、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.5.4 精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備質(zhì)控樣品，各質(zhì)量濃度平行6份，在“2.4”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3 d，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，各成分日內(nèi)、日間精密度均小于15%，方法回收率均在85%～115%范圍內(nèi)，表明該方法精密度、準(zhǔn)確度均良好。

表3 各成分精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.5.1 室溫穩(wěn)定性 將質(zhì)控樣品在室溫下密封放置24 h。

2.5.5.2 凍融穩(wěn)定性 將質(zhì)控樣品在-20 ℃下密封放置24 h，再于37 ℃水浴中解凍，待完全融化后重新在-20 ℃下密封放置24 h，重復(fù)上述操作3次。

2.5.5.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性 將質(zhì)控樣品在-20 ℃下密封放置1個(gè)月。

2.5.5.4 結(jié)果分析 表4顯示，各成分在不同條件下的準(zhǔn)確度較高，表明質(zhì)控樣品穩(wěn)定性良好。

表4 各成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5.6 回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取空白血漿800 μL，加入“2.3”項(xiàng)下混合溶劑4 mL，混勻，渦旋30 s，超聲處理2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，置于10 mL EP管中，45 ℃ N2吹干，分2次加入上述混合溶劑，每次400 μL，超聲處理2 min溶解殘?jiān)喜?次溶液，置于1.5 mL EP管中，45 ℃ N2吹干，加入“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，再加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，45 ℃ N2吹干，加入甲醇100 μL，超聲處理2 min溶解殘?jiān)?2 000 r/min離心10 min，取上清液，得到基質(zhì)效應(yīng)樣品，以質(zhì)控樣品、對(duì)照品峰面積比值為回收率，基質(zhì)效應(yīng)樣品、對(duì)照品峰面積比值為基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，各成分回收率均符合生物樣品檢測(cè)萃取回收率要求，并且均無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。

表5 各成分回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究 按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，在“2.4 ”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)各成分血藥濃度，再采用DAS 2.0軟件，通過(guò)統(tǒng)計(jì)矩模型分析計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6、圖2。由此可知，大鼠灌胃給藥后各成分均能較快吸收入血，Tmax均為1 h，血藥濃度-時(shí)間曲線呈多峰現(xiàn)象，但第2個(gè)峰的峰值濃度明顯低于第1個(gè)峰，表明體內(nèi)吸收均較快，可能存在肝腸循環(huán)[6-8]；異甘草苷t1/2最短，表明該成分體內(nèi)消除較快，而其他4種成分消除速率中等[9]。

表6 各成分主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論與結(jié)論

LC-MS既具有高效液相的分離能力，又具有質(zhì)譜的靈敏度和高選擇性，近年來(lái)被越來(lái)越多地用于藥物代謝成分研究[10-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用該方法測(cè)定復(fù)方西羚解毒膠囊中甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元含量，發(fā)現(xiàn)其靈敏快速，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，在30 min內(nèi)即出峰完畢。

結(jié)果顯示，復(fù)方西羚解毒膠囊中甘草酸含量最高，可快速吸收入血，消除速率中等，具有顯著的抗炎、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)、抗腫瘤活性[13-15]；黃酮類成分甘草苷、異甘草苷、芒柄花素含量較高，也可快速吸收入血，具有抗炎、抗?jié)儭⒖拱滩〔《尽⒖鼓[瘤等多種作用[16-18]；牛蒡子苷元是牛蒡子中的單環(huán)氧木脂素類化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤活性[19-20]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方西羚解毒膠囊中甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元進(jìn)行了藥動(dòng)學(xué)研究，可為闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)提供重要參考依據(jù)。另外，該制劑還含有大量酚酸類成分，但由于其理化性質(zhì)與上述5種成分有一定差異，故未進(jìn)行相關(guān)研究，今后將作進(jìn)一步考察。