不同桑品種的桑葉和桑椹α-生育酚含量測定分析

唐 露，黃傳書，宋志光，邢康康，劉 艷

(1. 重慶市蠶業科學技術研究院，重慶 400700；2. 重慶市中藥研究院，重慶 400065)

【研究意義】生育酚(維生素E)，根據甲基數目和位置的不同分為α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚4種不同形式[1]，是一類脂溶性的強抗氧化劑的同類物質統稱，在體內具有良好的抗氧化活性，體內活性順序為α-生育酚>β-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚，其中α-生育酚的生物活性最強，通常生育酚活性主要由α-生育酚體現[2]。α-生育酚作為一種重要的微量營養成分，參與功能信號轉導、基因表達調控及抗低溫脅迫等多種代謝途徑，在提高動物和人體的免疫力和應激力、維持正常的生殖功能、清除細胞自由基、抑制不飽和脂肪酸腐敗及植物葉綠體提供光合保護作用等方面都發揮著重要作用[3-4]。生育酚具有重要的生物學功能，只能由具有光合能力的生物合成，人類和動物只能通過食用植物性食物或提純的維生素E膠囊進行補充[5]。因此挖掘高α-生育酚含量的植物資源，為維生素E產品的開發利用奠定原料基礎，具有重要的現實意義。【前人研究進展】桑樹(Morusalba)在中國有幾千年的栽植歷史，種質資源豐富，傳統栽桑主要用于養蠶。桑樹中含有生物堿、黃酮、多糖、多酚、氨基酸、維生素等豐富的功能性活性物質，具有抗炎[6]、降血糖[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、降血壓[10]、清除自由基抗衰老[11]等多種功效。目前，桑樹在營養保健、畜禽養殖、生態治理等方面已得到很好的利用。對桑樹功能物質的研究主要包括DNJ、黃酮類物質、花青素、多酚及多糖等幾大類[12-15]。【本研究切入點】重慶市蠶科院“桑樹種質資源創新及應用”課題組在前期研究中對桑樹葉片的α-、β-、γ-、δ- 4種生育酚含量進行了檢測，發現葉片中α-生育酚含量最高，達 55.07%，但目前關于西南地區主推桑樹資源α-生育酚含量的研究還未見報道。本研究擬對西南地區主推桑資源的桑葉、桑椹中α-生育酚含量進行檢測比較，以篩選高生育酚含量的桑資源，為當地桑品種改良及綜合開發利用提供新的途徑。【擬解決的關鍵問題】對西南地區32個主推桑品種的桑葉及13個果桑的桑椹中α-生育酚含量進行系統測定分析，篩選出高α-生育酚含量材料，以對桑樹中天然α-生育酚的提取及利用提供理論依據和技術支撐，為高生育酚含量桑品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料 供試材料來自重慶市蠶業科學技術研究院的桑品種保護資源圃，樹齡35年，其中編號2～35的材料為葉用桑，編號36～48的材料為果桑品種，具體編號及品種名詳見表1。

表1 供試桑品種及編號

續表1 Continued table 1

1.1.2 主要試劑與儀器 干式氮吹儀(無錫沃信儀器有限公司)、島津LC-20AT液相(日本島津公司)、C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津公司)、低溫離心機TLG-16(湖南湘儀動力測試儀器有限公司)、甲醇(色譜級，上海安譜實驗科技股份有限公司)、超純水。α-生育酚標準品購于Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液制備 稱取α-生育酚對照品1 mg，置于1 mL容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，配置濃度為1000 μg/mL的儲備液，4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 樣品前處理 2020年5月4日上午9時，天氣晴朗，每個品種隨機選取5株桑樹，每株從同側、中上段采集完全成熟的桑葉、桑椹，用去離子水沖洗，吸水紙干燥后，放入裝有干冰的泡沫箱，帶回實驗室先放入-20、-40 ℃低溫冰箱分別冷適應1 h，隨后保存于超低溫冰箱中備用。將供試樣品用液氮冷凍后經高通量植物組織研磨器磨碎，精確稱取0.1 g樣本，加入1 mL的1%BHT乙醇溶液，混勻后加入1 mL 10%氫氧化鉀溶液，混勻于85 ℃恒溫金屬浴中恒溫提取40 min。冷卻后加入2 mL石油醚振蕩萃取10 min，取出醚相，用超純水清洗3次，將清洗后的醚相氮吹至干，加入1 mL甲醇復溶，用針頭式過濾器過濾于帶有內襯管的樣品瓶內待測。

1.2.3 測定方法 α-生育酚的HPLC液相條件：島津高效液相色譜儀，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相的配制：超純水與甲醇的體積比為20∶80。開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設置進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，走樣時間25 min，檢測波長294 nm，設置完畢保存方法組。用流動相過柱子，待基線穩定后開始加樣。

1.3 數據統計分析

利用Excel 2010軟件進行數據統計，用SPSS 23.0軟件進行描述性統計、單因素ANOVA分析及Duncan多重比較、系統聚類分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

對配置的對照α-生育酚標液進行標準曲線測定，測試所得α-生育酚在11.899 min出現峰(圖1)，以峰面積為縱坐標(y)，生育酚含量為橫坐標(x)計算得到其校正曲線，y=7285.6x-69.1，R2=0.9998，表明其線性關系良好。

圖1 α-生育酚標準品圖譜Fig.1 Atlas of α-tocopherol standard

2.2 描述性統計分析

對32個品種的桑葉及13個品種的桑椹中α-生育酚含量進行總體描述性分析(表2)。可以看出，32個品種的桑葉中α-生育酚含量變化范圍為13.44～64.14 μg/g，均值為32.78 μg/g，變異系數為0.33，表明α-生育酚含量在桑樹葉片中存在豐富的變異，偏度和峰度系數大于0，表示其數據呈尖峰右偏分布；13個品種桑椹中α-生育酚含量變化范圍為0.48～13.10 μg/g，均值為5.48 μg/g，變異系數為0.83，表明變異極為豐富，數據整體呈扁平右偏分布。總體而言，桑葉中的α-生育酚含量大于桑椹中含量，其均值為桑椹平均含量的5.98倍。

表2 桑葉及桑椹的α-生育酚含量總體分析

2.3 品種間桑葉、桑椹中α-生育酚含量比較

方差分析(表3)表明，不同桑品種的桑葉α-生育酚含量存在極顯著差異(F=895.232，P<0.01)，具有統計學意義。在供試桑品種中，桑葉α-生育酚含量最高的是魯桑系品種農桑12(16號材料)，其含量高達64.14 μg/g，顯著高于其余31個品種；含量最低的是魯桑系湖桑14(21號材料)，含量僅為13.44 μg/g，約為最高含量的1/5，為平均含量的2/5，顯著低于其他品種。

表3 32個品種的桑葉α-生育酚含量比較

方差分析(表4)表明，不同品種的桑椹α-生育酚含量間存在極顯著差異(F=1100.219，P<0.01)。其中，桑椹α-生育酚含量最高的是魯桑系品種紅果1號，為13.1 μg/g，最低的是嘉陵30號，僅為0.48 μg/g。

表4 13個品種的桑椹α-生育酚含量比較

2.4 不同桑系的α-生育酚含量比較

對不同桑系的α-生育酚含量進行比較分析(表5)，魯桑系桑樹葉片的α-生育酚含量最高，變異范圍為12.91～64.52 μg/g，均值為34.88 μg/g；山桑系的α-生育酚含量最低，變異范圍20.20～41.78 μg/g，均值為30.58 μg/g；白桑系的α-生育酚含量亦較低，均值為31.51 μg/g。

表5 不同桑系的α-生育酚含量比較

2.5 聚類分析

當歐式平方距離值為3時，可將32份材料聚類成3大類及2個單樣(圖2)，將2個單獨聚類的個體(編號16、21)根據特性歸屬到3大類中。類群1有8個品種(編號為18、22、8、5、9、10、13、20)，其α-生育酚含量范圍在30.17～35.52 μg/g，均值為32.65 μg/g，主要集中了中等含量的品種；類群2共有13個品種(編號為24、32、29、7、30、14、6、33、35、12、23、19、21)，其α-生育酚含量范圍在13.44～27.13 μg/g，均值為22.79 μg/g，主要集中了較低含量的品種；類群3包括了α-生育酚含量較高的11個品種(編號為26、27、28、34、2、3、4、11、17、14、16)，其變化范圍為37.36～64.14 μg/g，均值達到44.69 μg/g。

圖2 32個葉用桑品種的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 32 mulberry varieties for leaves

2.6 高α-生育酚含量桑資源鑒定

參照李國營等提出的谷子高生育酚含量分類標準[16]，以樣品α-生育酚含量的平均值及標準差為分類依據，得到α-生育酚含量閾值分別為43.61、21.95 μg/g，即高α-生育酚含量≥43.61 μg/g，低α-生育酚含量≤21.95 μg/g，中等α-生育酚含量為21.95～43.61 μg/g。依據上述標準，在32個桑品種中，α-生育酚含量大于43.61 μg/g的共有5個品種，分別為農桑2號、育2號、樂山紅花桑、農桑8號、荷葉白，占供試品種數的15.6%；低α-生育酚含量組共有4個品種，分別為湖桑14、新一之瀨、西農8202、青皮湖桑，占供試品種數的12.5%；中α-生育酚含量組共有23個品種，占供試品種數的71.9%(圖3)。

圖3 32個桑品種的α-生育酚含量分類Fig.3 Classification of α-tocopherol content in 32 mulberry varieties

3 討 論

α-生育酚作為生育酚的重要成分之一，在人體及動物中氧化活性最高。前人研究表明，植物葉片中生育酚以α-生育酚為主，且α-生育酚與總生育酚含量呈極顯著正相關關系，故研究桑葉及桑椹的α-生育酚是符合客觀規律及科學實踐要求的。本研究通過測定和分析顯示，32個葉用桑的葉片α-生育酚平均含量為32.78 μg/g，桑椹α-生育酚平均含量僅為5.48 μg/g，桑葉α-生育酚含量是桑椹的5.98倍。閆蒼等[17]研究認為，不同組織中生育酚含量及比例的不同，可能與各成分在不同組織中所發揮的作用不同相關。馮光燕等[18]對16個紫花苜蓿(MedicagosativaL.)材料葉片的生育酚含量進行測定，結果顯示，其維生素E含量平均值為31.81 μg/g，其中α-生育酚含量介于17.09～59.92 μg/g，均值為30.5 μg/g；謝蒙膠等[19]研究表明，16個生菜(LactucasativaL.)葉中維生素E含量僅為0.2～0.8 μg/g。本研究中桑葉α-生育酚含量高于上述兩物種，表明桑葉可作為天然維生素E提取及利用的良好原料。Munné-Bosch等[20]研究認為，不同生長期的植物體內VE含量會表現出明顯的差異，本研究僅對春季桑葉及桑椹中α-生育酚含量進行了測定，未對不同生長階段、不同器官組織的生育酚含量做系統分析，今后應進一步探究桑樹不同生育期、不同部位的生育酚含量變化規律。

結合品種所屬桑種分析發現，魯桑系品種的葉片α-生育酚含量最高，山桑系和白桑系品種的α-生育酚含量較低，可見，α-生育酚含量在不同桑系中有較大差異，可能是桑樹品種在生長過程中，不同地域和生態條件下對其進行自然選擇的結果。本研究僅對西南地區主推的桑品種進行了測定分析，所選桑品種不夠全面，下一步還需擴大范圍，研究全國不同區域的桑品種生育酚含量分布規律，探討地理環境和遺傳選擇對桑樹生育酚含量的影響。

Abbasi等[21]研究認為，α-生育酚含量增高可以提高植物對鹽分脅迫的耐受性和抵抗力；隋炯明等[22]研究也表明，在花生(ArachishypogaeaLinn.)中過表達生育酚合成關鍵基因以提高生育酚含量，增強了花生對鹽分脅迫的耐受能力；Collin等[23]研究表明，重金屬離子脅迫會誘導生育酚合成基因表達，以抵抗重金屬的侵害；Cela等[24]發現擬南芥中生育酚含量的變化可影響植物對生物脅迫的反應；郭娟等[25]研究發現，轉vtel基因的煙草(NicotianatabacumL.)較野生型植株，具有更強的抗旱性和耐鹽性。綜上，生育酚在植物逆境生長中可能發揮著積極的作用，生育酚含量是否可以作為抗逆桑品種選育的一個參考指標，進行優良抗逆性狀聚合育種在今后的試驗中需要更深入的研究。

4 結 論

本研究通過對桑樹α-生育酚含量進行測定分析，將參試32個葉用桑品種分為3類，即中等含量組(8個品種)、低含量組(13個品種)及較高含量組(11個品種)3類；鑒定出農桑2號、育2號、樂山紅花桑、農桑8號、荷葉白等5個高α-生育酚含量桑品種，為今后桑種質資源的挖掘和品質改良育種提供有益思考。