云南低緯高原甘蔗梢腐病菌檢測鑒定及系統進化分析

王曉燕，倉曉燕，李文鳳，李 婕，李銀煳，單紅麗，張榮躍，盧文潔，黃應昆

(1. 云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南 開遠 661699；2. 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，昆明 650205)

【研究意義】梢腐病是一種重要的世界性甘蔗真菌病害[1-3]。據報道，在印度該病的病株率為51.4%，甘蔗減產24.9%，每年造成250億盧比的損失[4-5]。自20世紀80年代以來，中國所有甘蔗種植區都發生了梢腐病[6-7]。2000年來，因感病品種ROC 1、ROC 10、ROC 16、ROC 22、ROC 25和粵糖93-159的大規模推廣，梢腐病頻發且態勢日趨嚴重[3]。近年因多雨高濕和感病品種粵糖93-159、ROC 25、ROC 1和川糖79-15的大面積種植，梢腐病在云南省臨滄市、普洱市、玉溪市和紅河州等地暴發，嚴重減產減糖[8]。據調查，嚴重發病時，病株率均值為81.1%，最高為100%；實測甘蔗產量平均損失38.42%，最高為48.5%；甘蔗糖分降低均值為3.14%，最高為4.21%[9]。為實現低緯高原云南蔗區甘蔗梢腐病的抗病育種和精準科學防控，有必要對該病的病原菌種類、優勢種和系統進化關系等進行綜合研究。【前人研究進展】鐮刀菌復合種(Fusariumsp.)是甘蔗梢腐病的病原菌[10]。能夠引起梢腐病的鐮刀菌種類繁多，目前已報道的有7種，分別為F.andiyazi(Fa)、F.incarnatum(Fi)、F.oxysporum(Fo)、F.verticillioides(Fv)、F.proliferarum(Fp)、F.sacchari(Fsa)和F.subglutinans(Fsu)[11-13]。不同國家梢腐病病原菌種群及優勢種不同。馬來西亞的梢腐病病原菌是Fp、Fsa和Fsu，優勢種是Fsa[14]；伊朗是Fv、Fp和Fsu，優勢種是Fv[11-12]；南非是Fa、Fp和Fsa，優勢種是Fsa[15]；菲律賓是Fsa、 Fp、 Fi、Fv和Fsu，優勢種是Fsa[13]；中國已確定能引起甘蔗梢腐病的病原菌有Fsa、Fv、Fp和Fo，優勢種為Fv[16-18]。【本研究切入點】云南省作為中國第二大蔗區，主要分布在以滇西為主的亞熱帶濕潤多光照蔗區和滇南為主的亞熱帶半濕潤蔗區[19]，近年來因氣候異常，甘蔗梢腐病暴發成災趨勢明顯，蔗莖大量枯死，已是減產減糖最嚴重的第一大病害。在病原研究的基礎上種植和培育抗病品種是防控梢腐病最經濟有效的措施，但有關云南蔗區梢腐病病原菌種類、優勢種及其病菌間的系統進化等方面研究較少，導致有效防控缺乏可靠依據。【擬解決的關鍵問題】通過對采自云南不同蔗區的梢腐病樣品進行病原菌PCR檢測，以期明確該區域梢腐病的主要病原菌和優勢種，為選育甘蔗梢腐病抗病品種和病害精準防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2020年對云南省耿馬縣,孟連縣，新平縣，瀾滄縣勐朗鎮勐濱村、上允鎮，開遠市和彌勒市等低緯高原不同蔗區災害性病蟲發生危害進行調查，從12個嚴重發病的甘蔗品種上采集了14份具典型梢腐病癥狀的樣品，觀察并記錄病害癥狀(表1)。

1.2 甘蔗梢腐病優勢種的PCR檢測鑒定

1.2.1 引物設計與合成 根據參考文獻報道的F.verticillioides(Fv-F4/Fv-R4)和F.proliferatum(Fp-F3/Fp-R3)特異性引物[20]對甘蔗梢腐病病原菌進行PCR檢測，預期目的片段大小為400 bp。

1.2.2 總DNA的提取 取病葉0.1 g，按照真菌基因組DNA提取試劑盒(上海生物工程股份有限公司生產)的說明書提取病葉總DNA。

1.2.3 PCR檢測 25 μL PCR反應體系中含DNA模板 2 μL、TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各2.5 μL(10 μmol/L)，滅菌ddH2O 5.5 μL。PCR反應條件為95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，63 ℃ 15 s，72 ℃30 s，30個循環；最后72 ℃10 min。

1.2.4 PCR產物克隆、測序及序列分析 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司生產)回收目的片段，并將其與pEASY-T5(北京全式金生物技術有限公司生產)進行連接轉化，并把陽性克隆送重慶華大基因測序。在Genbank中對所得序列進行Blast檢索和同源性分析。

1.3 數據統計與分析

從GenBank中下載已有甘蔗梢腐病病原菌的rDNA-ITS序列，用MEGA 6.0軟件[21]構建Neighbor-Joining系統進化樹，建樹模式為Kimura 2-parameter，

自舉檢測(bootstrap)重復1000 次，甘蔗黑穗病病原菌(GenBank登錄號：EF185083)為外群。

2 結果與分析

2.1 甘蔗梢腐病病害癥狀

14份病樣具有典型的甘蔗梢腐病癥狀特征，表現為甘蔗葉片畸形扭曲纏結，變色，病斑上有紅褐色條紋，楔形縱裂形似階梯(圖1)。

A: 葉片變形扭曲；B: 紅褐色條紋、變色和階梯狀葉片A: Deformed and twisted leaf; B: Reddish-brown stripes, discolored, and stepped leaves圖1 甘蔗梢腐病田間典型癥狀Fig.1 Typical field symptoms of sugarcane pokkah boeng

2.2 病原菌分子鑒定結果

14份甘蔗梢腐病樣品中有12份都擴增出大小約400 bp的目的條帶(圖2)，表明12份樣品均檢測到Fv和Fp。選取7份混合侵染樣品的PCR產物進行測序，所得序列提交GenBank。用BLAST在GenBank中搜索同源序列，結果表明，7份混合侵染樣品的Fv(GenBank登錄號：MZ126549～MZ126555)和Fp(GenBank登錄號：MZ102259～MZ102265)序列分別與GenBank數據庫中Fv菌株20(GenBank登錄號：KU508286)和Fp德宏菌株(GenBank登錄號：KJ629482)的一致性為98.6%～100%和100%，明確Fv和Fp是低緯高原云南蔗區梢腐病的病原菌，且存在混合侵染現象(表1)。

A：Fv的PCR擴增結果；B： Fp的PCR擴增結果；1～7: 樣品KY1, KY2, KY3, ML1, ML2, ML3 和 ML4; Pc: Fv DNA (A)，Fp DNA (B); Nc: 甘蔗黑穗病菌DNA; CK: ddH2OA: The PCR amplification result of Fv; B: The PCR amplification result of Fp; 1-7: Samples of KY1, KY2, KY3, ML1, ML2, ML3 and ML4; Pc：Fv DNA(A)，Fp DNA(B)；Nc: DNA from sugarcane smut pathogen;CK:ddH2O圖2 部分甘蔗梢腐病樣品PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification result of some sugarcane pokkah boeng samples

表1 14份甘蔗梢腐病樣品病原菌鑒定結果

續表1 Continued table 1

2.3 系統進化分析

系統進化樹中云南蔗區梢腐病病原菌主要分成兩組，即Fv組和Fp組。除來自云南瀾滄ROC 25和云南彌勒福農10-1405上的Fv單獨聚為一個小組外，在Fv組中，5個混合侵染樣品與不同地理來源Fv菌株聚為一組，并與Fo(廣西菌株)有較近的親緣關系。就Fp而言，本研究獲得的Fp序列與不同地理來源Fp菌株聚為一組(圖3)。

圖3 甘蔗梢腐病菌ITS序列系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analyses of sugarcane pokkah boeng isolates based on rDNA-ITS sequences

3 討 論

甘蔗梢腐病是一種重要的真菌病害，發生在甘蔗的整個生長期。感病后，甘蔗葉片褪綠黃化、縮皺扭曲，最終導致甘蔗停止生長或梢部腐爛，從而影響甘蔗產量形成和糖分積累[22]。部分感病品種的發病率高達80%以上，給甘蔗生產造成巨大損失，該病嚴重制約蔗糖產業可持續高質量發展[23-25]。目前，對甘蔗梢腐病的研究主要集中在病原菌分離鑒定、病原菌生物學特性和抗性評價等方面[26]，并報道了多個鐮刀菌能引起梢腐病的發生，且蔗區不同種群及優勢種也不同[11-18]。云南是中國第二大蔗區，近年來由于多雨高濕和感病品種大面積種植，云南蔗區暴發梢腐病，為科學精準防控該病，保障蔗糖產業的高質量發展，本研究對采自云南不同蔗區的梢腐病樣品進行PCR檢測鑒定，初步確定低緯高原云南蔗區的梢腐病病原菌為Fv和Fp。

2014年Lin等[16]對采自福建、廣東、廣西、云南和海南的不同甘蔗梢腐病進行病原菌鑒定和系統進化分析，確定引起甘蔗梢腐病的病原菌有Fv和Fp。Fv占菌株總數的93%，為優勢種，一般在高溫高濕的條件下發生嚴重；Fp占菌株總數的7%，耐低溫，致病性較弱，一般在冬季危害。雖然本研究中云南甘蔗梢腐病的病原菌也是Fv和Fp，但14份梢腐病樣品中就有12份均檢測出2種病原菌，混合侵染現象普遍存在，表明單株中多種病原菌共存是梢腐病病原菌研究中不可回避的事實，有必要對這種共存模式形成的機制及其在侵染致病中的作用做進一步研究。

系統進化分析中，Fv和Fp 2種梢腐病病原菌無明顯品種和地理差異性，然而來自低緯高原云南蔗區的Fv不同菌株分布于不同的分支上，說明云南Fv菌株間存在廣泛的遺傳多樣性，同時也表明低緯高原云南蔗區可能是中國Fv多樣性分布的一個核心區域。

4 結 論

本研究采用分子鑒定方法，通過對云南省耿馬縣，孟連縣，新平縣，瀾滄縣勐朗鎮勐濱村、上允鎮，開遠市和彌勒市等蔗區采集到的14份甘蔗梢腐病病原菌進行檢測和序列分析，初步確認Fv和Fp是低緯高原云南蔗區梢腐病的病原菌，混合侵染現象普遍存在，為進一步研究甘蔗梢腐病及其科學防控奠定了基礎。