春尺蠖幾丁質酶AcinCht10基因的克隆及在逆境脅迫下的表達

陳 龍, 董飛龍，寇 峰，查 干，崔闊澍，馬杰茹

(1. 河套學院農學系，內蒙古 巴彥淖爾 015000; 2. 磴口縣林業和草原有害生物防治檢疫站，內蒙古 巴彥高勒 015299; 3. 磴口縣防沙治沙局，內蒙古 巴彥高勒 015299; 4. 巴彥淖爾市草原工作站，內蒙古 巴彥淖爾 015000; 5. 四川省農業技術推廣總站，成都 610041)

【研究意義】春尺蠖(Apocheimacinerarius)是鱗翅目、尺蛾科雜食性昆蟲。該昆蟲在我國多個省(市、自治區)危害牧草、林木和經濟樹種[1-2]，在內蒙古地區主要危害檸條。近年來，春尺蠖的危害對象逐漸由楊、桑、柳、檸條以及經濟類果樹等林木擴散至玉米和小麥等大田作物，區域也由北部地區的內蒙古及新疆向四川、云南等南部地區擴散。幼蟲最早于4月上旬開始發生危害，此時當地晝夜溫差較大，最低可達-10 ℃，同時在荒漠化草原中生存需要很強的耐饑餓能力，春尺蠖3齡和4齡幼蟲能在如此環境中生存下來且發生危害，與其極強的抗寒性和耐饑性密切相關。【前人研究進展】幾丁質在昆蟲的角質層、內表皮、圍食膜和體壁均有分布，同時還分布于呼吸系統、腔腸結構等組織，在昆蟲中起到維持體型、限制昆蟲生長及抵御外界不利環境對機體的傷害等作用[3-5]。在昆蟲生長發育及蛻皮的發育過程中，部分舊角質層中的幾丁質需要降解，用新生成的角質層來替代[6-7]。幾丁質酶( Chitinase)和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(β-N-acetyglucosaminidase)在昆蟲蛻皮中具有重要作用，只有二者共同作用才能完成該生理過程[8]。幾丁質酶在昆蟲的蛻皮、圍食膜的降解和昆蟲消化等生理過程[9-13]均發揮重要的作用，昆蟲生長發育的各個階段與幾丁質酶有緊密的聯系。因此，只要幾丁質酶在昆蟲不同組織和不同生長發育階段維持一定的表達量，昆蟲的正常生長發育過程才能得到保證[14]。根據幾丁質酶基因所編碼氨基酸的序列同源性，昆蟲幾丁質酶隸屬于18家族幾丁質糖基水解酶，該類基因的特點為：大多數均由信號肽，催化區、連接區和幾丁質結合區構成。通過生物信息學分析與構建系統進化樹等方式，可將幾丁質酶及其類似蛋白劃分為I～VIII型[11]，在昆蟲不同的生長發育階段和不同組織中均體現了這些類型幾丁質酶基因的功能差異[15]。赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)的III型幾丁質酶由2個催化區和1個幾丁質結合域構成，在其N端還發現1個跨膜結構域，屬于膜結合蛋白，其在兩個完全不同的方面(蛹腹部收縮和翅伸展)均發揮重要作用[11]。相關研究表明，幾丁質酶還在植物抗菌、抗逆境、生長發育以及共生固氮等方面扮演重要角色[16-22]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)幾丁質酶基因的表達與逆境脅迫相關[23]。目前，關于昆蟲幾丁質酶在逆境脅迫功能探究報道較少。在小胸鱉甲(Microderapunctipennis)低溫脅迫的轉錄組數據中發現大量幾丁質酶基因與低溫脅迫的響應密切相關[24]，同時還發現MpCht19和MpCht8c均受低溫誘導表達，且MpCht19基因具有組織特異性[25-26]。在經過饑餓處理的3齡桔小實蠅(Orientalfruit)幼蟲體內發現BdCht2上調表達，當恢復飼喂后BdCht2基因的表達則被抑制，表明在桔小實蠅蛻皮過程中BdCht2起著重要作用[27]。已有研究證實，赤擬谷盜中(Triboliumcastaneum)TcCht10參與在卵至成蟲的各個階段[28]，同時發現第 III 組昆蟲幾丁質酶 Chitinase 7還在生長發育過程中的幾丁質的排布[29]。黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)X組幾丁質酶Cht2有助于提高表皮的沉積以及抵御細菌滲透的穩定性[30]。【本研究切入點】為深入了解幾丁質酶基因在春尺蠖抵御外界不良環境中的作用，本研究利用本實驗室已測春尺蠖3齡和4齡轉錄組數據，基于測序所得基因序列信息，結合NCBI blastp和RT-PCR技術克隆獲取1個幾丁質酶基因，分析其序列分子特征及氨基酸理化性質，對其序列進行比對并構建系統進化樹，同時分析其在不同溫度和饑餓脅迫下的表達譜。【擬解決的關鍵問題】明確幾丁質酶基因在春尺蠖逆境脅迫中作用，為進一步揭示春尺蠖響應逆境脅迫的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及樣品處理

將2021年春季采集于內蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗檸條草場(108°45′23.63″E, 40°46′4.19″N)的春尺蠖雌雄成蟲置于實驗室內在室溫配對飼養(飼喂檸條錦雞兒)，待其產卵后放置于(22±1) ℃，光周期L∶D=18∶6，相對濕度為55%～59% 的ZXQP-R1700上海智城人工氣候箱中孵化，孵化后的1齡幼蟲以檸條錦雞兒連續飼養，待幼蟲分別發育至3齡和4齡時，進行以下處理：①低溫處理(3齡幼蟲)：選取3齡幼蟲(蛻皮后2 d)分別在-10、-5、0、5和25 ℃(對照)下各處理1 h，每個溫度處理5頭；②饑餓脅迫(4齡幼蟲)：選取4齡幼蟲(蛻皮后2 d)分別饑餓處理 0(CK)、6、24和72 h，每組處理3頭。上述處理的昆蟲用液氮速凍后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑

RNA提取、反轉錄、pMD19-T載體、2×PCR Master Mix等均購自大連寶生物有限公司；大腸桿菌感受態細胞DH5α購自于北京天根生化科技有限公司。

1.3 RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

將春尺蠖各供試樣品從-80 ℃冰箱中取出，放置于滅菌后且已用液氮預冷的研缽中研磨，RNA提取過程參照TaKaRa RNA提取試劑盒說明書，待提取完成后分別利用Nano PhotometerTMP-Class超微量分光光度計和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的濃度和質量，待濃度和質量檢測合格后反轉錄合成第1鏈。

1.4 春尺蠖AcinCht10基因的克隆

本實驗通過分別分析春尺蠖3齡不同溫度處理下及4齡幼蟲不同時間饑餓脅迫下的轉錄組差異表達情況，結合NCBI blastp與基因注釋結果，篩選獲取一條在上述兩種脅迫下均差異表達且具有完整CDS序列的幾丁質酶基因。基于轉錄組基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物擴增春尺蠖幾丁質酶基因。以在上述兩種處理條件下PCR擴增產物最亮條帶樣品的cDNA為模板。采用兩段式擴增目的基因，第一段擴增引物(250～2166 bp)為F:5′-TTGTGTGGTCAAGGATATCTTGTAAAA-3′和R:5′-CTTCATAGACGAACTGGTTCATGCG-3′；第二段擴增引物(1939～3282 bp)為F: 5′-ACCCTAATCTCTGCACTCACATGAT-3′和R: 5′-GTTTTTGTTTAAGGGTATCTGCTAAT-3′。

PCR采用25 μL反應體系，其中PCR擴增cDNA模板1 μL，正反引物各取1 μL，Master Mix 12.5 μL，剩余體積以RNase-free Water補齊。設置PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸運行1 min，循環運行30次；72 ℃補齊延伸10 min，而后4 ℃保存。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳將兩段PCR擴增產物電泳檢測片段，而后經膠回收和亞克隆送上海生物工程有限公司測序。

1.5 春尺蠖AcinCht10基因的生物信息學分析

利用NCBI在線網站ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測春尺蠖幾丁質酶基因的編碼蛋白區。使用在線軟件 ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)對春尺蠖幾丁質酶編碼氨基酸的基本理化性質進行預測；使用DNAMAN 6.0(Lynnon Biosoft, Canada)軟件對選取的其他昆蟲幾丁質酶基因與春尺蠖幾丁質酶基因的序列一致性進行分析；利用SignalIP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線預測工具對春尺蠖幾丁質酶N端信號肽進行預測；蛋白跨膜區則利用TMHMM在線網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測；利用NetPhos 2.0 Server在線工具 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測其磷酸化位點，同時利用DictyOGlyc 1.1在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)對春尺蠖幾丁質酶進行糖基化位點預測。利用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)、p距離(P-distance)，重復運算1000次。

1.6 春尺蠖AcinCht10基因逆境條件下的表達

為明確春尺蠖幼蟲在逆境脅迫下(低溫與饑餓)的表達譜，本研究基于前期實驗室已測轉錄組數據(不同低溫及不同時間饑餓處理)，基于FKPM值，對春尺蠖AcinCht10基因的表達情況進行分析。

1.7 數據統計與分析

利用SPSS 17.0軟件中的單因素中Duncan多重比較分析AcinCht10基因表達結果，同時應用GraphPad Prism 7.0軟件繪制柱形圖，方差分析結果采用平均值±標準誤的形式展現，顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 春尺蠖AcinCht10基因的克隆

基于轉錄組數據中的FASTA文件的幾丁質酶基因的序列信息，利用兩對引物分段擴增，經1.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，分別在1917 bp(圖1-A)和1344 bp(圖1-B)處有特異性單一條帶，經測序后將2段序列拼接后共獲取2967 bp，與轉錄組數據比對后，序列信息一致，命名為AcinCht10(基因登錄號：OK504624)。

圖1 AcinCht10基因片段PCR產物檢測Fig.1 PCR production detection of AcinCht10 from Apocheima cinerarius

2.2 AcinCht10基因蛋白的生物信息學分析

春尺蠖AcinCht10基因編碼蛋白理化性質預測結果表明，春尺蠖AcinCht10基因序列CDS全長為2967 bp，共編碼988個氨基酸，預測分子式為C5017H7689N1349O1490S39，蛋白的預測分子量111.99 kDa，理論預測等電點為6.25；半衰期和脂肪指數分別為30 h和69.62，負電荷殘基(Asp+Glu)總電荷為136，正電荷殘基(Arg+Lys)總電荷為127；該蛋白的親水性系數為-0.547，為親水性蛋白。N端氨基酸為蛋氨酸(Met, M)，預測不穩定系數值為37.19，因其小于40，所以該蛋白為穩定蛋白。AcinCht10在N端含1條含26個氨基酸的(MWPPRLLRWTL TILLILAVIAPTSNS)信號肽(圖2-A)，無跨膜區(圖2-B)。此外，該蛋白具有2個催化區，分別位于第95～439位和第531～870位氨基酸，同時具有1個幾丁質結合域，位于第923～977位氨基酸(圖3)，磷酸位點檢測(圖2-C)發現絲氨酸48個，蘇氨酸43個，酪氨酸14個；未檢測到糖基化位點(圖2-D)。

Transmembrane. 跨膜區；Inside. 蛋白質在膜內的概率；Outside. 蛋白質在膜外的概率Transmembrane. Transmembrane region; Inside. Probability of protein inside the membrane; Outside. Probability of protein outside the membrane圖2 春尺蠖幾丁質酶AcinCht10的信號肽、跨膜結構、磷酸化位點和糖基化位點預測Fig.2 Prediction of the signal peptide, transmembrane structure, phosphorylation sites and glycosylation sites of the AcinCht10 from Apocheima cinerarius

起始密碼子與終止密碼子用下劃線標注；催化結構域(CAD)用陰影標注；幾丁質結合域(CBD)用下劃線標注Start codon (ATG) and stop codon (TGA) are underlined; Catalytic domain(CAD)is shaded; Chitin binding domain (CBD)are underlined圖3 春尺蠖AcinCht10基因的核苷酸及推導的編碼氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and encoded deduced amino acid sequence of AcinCht10 in Apocheima cinerarius

2.3 春尺蠖幾丁質酶基因的同源性比對及系統進化關系分析

在NCBI中搜索其它鱗翅目昆蟲幾丁質酶基因的氨基酸序列，將搜索獲取的序列與春尺蠖AcinCht10進行序列一致性分析，結果(圖4)表明，AcinCht10與同鱗翅目昆蟲之間的一致性均≥91%，其中，春尺蠖AcinCht10與煙草天蛾(Manducasexta)的一致性最高，為93.12%，其次為粉紋夜蛾(Trichoplusiani)和亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)，分別為92.53%和92.32%，其與甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、桃蛀螟(Dichocrocispunctiferalis)和粘蟲(Mythimnaseparata)也均保持較高的一致性，分別為 91.90%、91.60%和91.30%。

Cht來源物種及其 GenBank 登錄號: 春尺蠖(AcinCht10，KO504624)；煙草天蛾(MsexCht10，XP_030022210.1)；粉紋夜蛾(TniCht10，XP_026728882.1)；亞洲玉米螟(OfurCht10，AGX32025.1)；甜菜夜蛾(SexiCht7，AFM38213.1)；桃蛀螟(CpunCht7，ASM94207.1)；粘蟲(MsepCht，AUF40393.1)；共有序列Source species of Cht proteins and their GenBank accession numbers:Apocheima cinerarius(AcinCht10，KO504624); Manduca sexta(MsexCht10，XP_030022210.1); Trichoplusia ni(TniCht10，XP_026728882.1); Ostrinia furnacalis (OfurCht10，AGX32025.1); Spodoptera exigua(SexiCht7，AFM38213.1); Conogethes punctiferalis(CpunCht7，ASM94207.1);Mythimna separata(MsepCht，AUF40393.1); Consensus 圖4 春尺蠖與其它昆蟲Cht基因的氨基酸序列比對Fig.4 Multiple amino acid sequence alignment of Cht from Apocheima cinerarius and other insects

使用MEGA 6軟件中的鄰接法構建系統進化樹, 春尺蠖Cht蛋白用三角標記The tree was constructed by MEGA 6.0 using the Neighbor-Joining (NJ) method, the Cht protein of Apocheima cinerarium was marked with filled triangle圖5 春尺蠖與其它昆蟲Cht氨基酸序列構建的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of Cht from Apocheima cinerarium and other insects

在NCBI中以Chitinase為關鍵字搜索其它昆蟲的幾丁質酶基因的氨基酸序列，結合春尺蠖AcinCht10基因的氨基酸序列構建系統進化樹。系統進化結果(圖7)顯示，各類昆蟲的8種幾丁質酶分別聚為一支上，同時春尺蠖AcinCht10與同為鱗翅目昆蟲的煙草天蛾MsexCht10、粉紋夜蛾TniCht10和亞洲玉米螟OfurCht10聚為一類。

2.4 春尺蠖AcinCht10基因在逆境脅迫下的表達分析

從圖6-A可以看出，AcinCht10基因隨著饑餓處理時間的增加，表達量依次降低且相鄰處理間的表達量差異不顯著(P>0.05)。AcinCht10基因在25 ℃處理下表達量最高，而在其余溫度脅迫下表達量均處于較低水平且差異不顯著(P>0.05，圖6-B)。

圖6 春尺蠖AcinCht10基因在不同時間饑餓處理和不同溫度脅迫下的表達Fig.6 Expression profile of AcinCht10 different starvation and at different temperature stress of Apocheima cinerarius

3 討 論

本研究基于前期已獲取的春尺蠖3齡幼蟲不同低溫處理和4齡幼蟲不同饑餓時間處理的轉錄組數據，篩選出在兩數據庫中共有差異表達的幾丁質酶基因，在NCBI中的blastp中驗證后，結合RT-PCR技術克隆獲取該基因的編碼蛋白區。經序列分析后發現，春尺蠖幾丁質酶基因具有兩個催化區域，一個幾丁質結合區域，符合幾丁質酶III型基因的特性[31]，而后經序列比對和系統進化分析，發現春尺蠖AcinCht10分別與煙草天蛾MsexCht10、粉紋夜蛾TniCht10和亞洲玉米螟OfurCht10等幾丁質酶III型基因序列一致性均在92%以上，且聚為一類，故將春尺蠖幾丁質酶基因鑒定為幾丁質酶III型基因，并命名為AcinCht10。

通過對AcinCht10基因進行生物信息學分析，AcinCht10基因的CDS全長2967 bp，共編碼988個氨基酸，預測分子量為111.99 kDa，與大多數昆蟲的幾丁質酶III型基因相似。該蛋白的理論預測等電點為6.25，親水性系數為-0.547，說明屬于親水性的酸性蛋白。AcinCht10基因蛋白第1～26位氨基酸位信號肽，屬于分泌蛋白，符合大多數幾丁質酶需要分泌道胞外特點。AcinCht10基因蛋白未發現跨膜區，說明其可能是非膜相關蛋白[32]。磷酸位點檢測發現絲氨酸48個，蘇氨酸43個，酪氨酸14個可能成為磷酸位點，推測其可能在信號轉導中扮演重要角色[33]。從AcinCht10與其它目昆蟲的幾丁質酶基因構建的系統進化樹中可以看出，8類幾丁質酶分別聚在一支上，而同一昆蟲的不同類型幾丁質酶基因則分布在不同分支上，在棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)和荒漠甲蟲小胸鱉甲(Microderapunctipennis)的研究中也有相同結果[19,34]，說明幾丁質酶基因在進化過程中分化程度較大，分化而來的8種不同類型的幾丁質酶基因具有不同的生理功能[17]。

昆蟲幾丁質酶在昆蟲生長發育的各個時期均扮演著重要角色，參與諸如昆蟲的蛻皮、圍食膜降解等過程，同時還在細胞增殖和應對外界不利環境的免疫等過程發揮作用[35-36]。近年來，相關研究發現幾丁質酶基因在應對低溫脅迫有作用。本研究中，在低溫處理下AcinCht10表達量并無明顯變化，但小胸鱉甲Mpcht19和MpCht8c在4 ℃條件下7 h后表達量顯著上調[18-19]，可能是由于AcinCht10處理時間為1 h，而小胸鱉甲的處理時間為7 h。有研究表明，長時冷馴化會伴隨著基因表達的較大變化[37-38]，而短時、快速馴化則很少有證據表明需要合成新的基因產物。在紅尾肉蠅的研究中也得到證實，該蟲0 ℃處理2 h后雖然使得抗寒性增強，但并未引起基因表達的變化[39]。本研究表明，春尺蠖AcinCht10基因在低溫脅迫下基因表達未發生顯著變化，可能由于處理時間過短，蟲體內不需要合成新的產物來抵抗外界低溫，但在25 ℃樣品處理的各環節中未發生異常，為何AcinCht10高表達，有待于今后進一步探究。

幾丁質酶基因家族中的幾丁質酶類型具有多樣化，每種類型的昆蟲體內具有的功能也不盡相同，在作用效應和呈現出的表型也有差異[31]。在桔小實蠅的研究中，饑餓增加了3齡幼蟲體內BdCht2的表達[20]，與本研究的結果相反，可能是由于二者隸屬于幾丁質酶家族的不同成員，BdCht2是VII型，而AcinCht 10則是III型幾丁質酶基因。鱗翅目昆蟲屬于全變態昆蟲，幼蟲生長到一定階段就會退掉舊皮，形成新的表皮，這個過程中則需要幾丁質合成通路及幾丁質降解途徑配合才能實現[40-41]。近年來，在對赤擬谷盜、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、褐飛虱(Nilaparvatalugens)等昆蟲海藻糖酶—幾丁質調控通路的研究中發現，幾丁質的合成與分解在一定程度上受海藻糖酶(TRE)的調控[42-45]。如在褐飛虱蟲體內注入海藻糖酶抑制劑后，10個幾丁質酶基因表達都顯著或者極顯著下降[46]。以上研究表明，幾丁質酶基因和海藻糖酶基因的表達是同步的。在本研究中，伴隨著饑餓處理時間的增加，幾丁質酶基因的表達量呈現下降趨勢，可能是由于隨著饑餓時間的增加，體內積累的海藻糖逐漸被分解，沒有多余的海藻糖可以分解(饑餓72 h后春尺蠖表現為活動減弱，呈現虛弱狀態)，導致海藻糖酶基因表達降低(未發表)，促使幾丁質酶基因下調表達。

雖然本研究已完成AcinCht10的克隆，分析了其分子特征，同時明確了該基因與其它昆蟲的系統進化關系，以及明確了其在低溫和饑餓脅迫下的表達情況，但是還有一些問題需要今后進一步明確。首先，本研究雖然分析了春尺蠖幾丁質酶基因在低溫和饑餓脅迫下的表達譜，但是還缺乏在上述兩種脅迫下的組織表達譜，基因的表達進一步精確到特定組織。其次，還未明確AcinCht10在同一溫度不同處理時間的表達情況，同時低溫脅迫還缺乏遞進式降溫處理，以此來模擬真實的自然環境。最后，春尺蠖體內還存在其它類型的幾丁質酶基因，還需今后進一步去挖掘，才能夠系統全面的明確春尺蠖在逆境脅迫下幾丁質酶基因調控的分子機理。

4 結 論

本研究基于轉錄組數據克隆獲取了春尺蠖幾丁質酶基因AcinCht10，并對其序列特征、理化性質及系統進化關系進行了分析，同時分析了該基因在低溫及饑餓脅迫下的表達情況。研究結果證明，春尺蠖幾丁質酶基因AcinCht10屬于III型，饑餓脅迫均可誘導下調表達，而在短時低溫脅迫下，表達量有變化但差異不顯著，以上結果揭示AcinCht10為春尺蠖在逆境條件下可被誘導表達，本研究結果有助于為今后開展春尺蠖抵御逆境脅迫分子機理的研究奠定基礎。